纳米孔测序技术鉴定陕西省首例马尔尼菲青霉菌感染病例

马 琳，刘东立，毛凌峰，王益群，丁 龙， 王安礼

马尔尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei，PM)是300余种青霉菌中唯一致病的双相型真菌[1]，在自然界寄生于竹鼠[2]，一般认为可污染环境通过气溶胶感染人类。PM可引起马尔尼菲青霉菌感染病(Penicilliosis marneffei，PSM)，常见于免疫抑制人群，是艾滋病常见的机会性感染性疾病之一。PSM流行于东南亚国家地区[3]及中国广东、广西、香港、台湾等省区[4]，近年国内外艾滋病疫情上升蔓延，旅游、商务等交流日益频繁，内陆省份也有输入性感染的报道[5]。宏基因组分析技术是对患者标本所含核酸进行高通量测序，通过生物信息学分析，与病原菌数据库查询比对，可获得可能感染的病原体信息[6]，节省了病原培养时间，并可对未知病原及无法培养的病原进行鉴定。纳米孔测序技术是近年来发展的第三代测序技术，MinION纳米孔测序仪小巧便携，具有建库迅速、超长读长、实时获取数据、实时分析等优点，在感染性疾病现场快速鉴定病原具有独特的优势[7]。2019年12月，本实验室利用纳米孔测序、分子诊断及双相培养确诊1例PSM的患者，为中国陕西省首次发现该病。本文就该病例的发现与病原学鉴定进行探讨。

1 材料与方法

1.1 临床资料 患者男性，33岁，中国陕西省汉中市人，常居西安市，职业为导游，经常带团去东南亚国家。于2019年11月初无明显诱因出现乏力、盗汗，无发热、咳嗽、腹胀、腹泻等不适，于当地诊所口服中药治疗10 d，效果不佳。11月19日就诊于陕西省汉中市中心医院，血常规检测提示“三系细胞均减低”，行骨髓穿刺检查，结果提示“粒系增生减低，可见疑似利杜氏小体样包涵体”，考虑不除外“黑热病”，建议上级医院就诊。11月25日患者出现咳嗽、白色粘痰，活动后气喘，无发热。就诊于“空军军医大学”，11月22日血常规检测白细胞计数0.95×109/L，血红蛋白62 g/L，血小板计数55×109/L 。11月28日骨穿报告仍可见“利杜氏小体样包涵体”，考虑“黑热病”。12月2日，患者出现发热，体温38.8 ℃，伴有畏寒、腹泻(约2～3次/d，水样便)，自觉咳嗽、气喘症状逐渐加重。12月4日在韩城市王峰卫生院进行利什曼原虫抗体检测为阴性，HIV抗体及梅毒抗体初筛阳性。为进一步明确诊断，收治医院送EDTA抗凝血样3 mL、骨髓样1 mL至本实验室进行检测。

1.2 材 料

1.2.1 试剂 瑞氏染液(青岛海博公司)，Dneasy Boodle&tissue DNA Kit(德国凯杰公司)，溶菌酶(西安天隆科技有限公司)，NEBNext FFPE Repair Mix、NEBNext ΜLtra II End repair/dA-tailing ModμLe、NEBNext Quick Ligation ModμLe(美 国 New England Biolabs公司)，Agencourt AMPure XP磁珠(贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司)；QubitTM1X dsDNA HS Assay Kits、Nuclease-free water(赛默飞世尔科技中国有限公司)；Genomic DNA by Ligation (SQK-LSK109)、R9.4.1 Flow cell 测序芯片(英国 Oxford Nanopore Technologies 公司)；沙氏葡萄糖琼脂(北京陆桥公司)。

1.2.2 仪器 生物显微镜(奥林巴斯CX31)，QIA Cube全自动核酸提取仪(德国凯杰公司)，Qubit 4.0(赛默飞世尔科技中国有限公司)，MinION测序仪(英国Oxford Nanopore Technologies公司)，ABi Q5荧光定量PCR仪(赛默飞)，Qxcel Advance毛细管电泳仪(德国凯杰公司)，生化培养箱。

1.3 方 法

1.3.1 显微镜检查 分别取抗凝全血及骨髓标本20 μL，于载玻片涂片，自然干燥后瑞氏染色，置油镜下观察。

1.3.2 宏基因组测序 核酸提取：取血液样本200 μL，加入溶菌酶，37 ℃ 10 min，使用Dneasy Blood&Tissue DNA Kit，以革兰氏阳性菌/酵母菌提取程序提取样本核酸，-20 ℃保存。

文库制备：对提取的核酸进行以Qubit 4.0定量，换算后取1 μg DNA以Nuclease-free water调整体积至49 μL，取47 μL加入0.2 mL PCR管，然后加入3.5 μL NEBNext FFPE DNA Repair Buffer、5μL NEBNext FFPE Repair Mix、3.5 μL ΜLtra II End-prep reaction buffer、3 μL ΜLtra II End-prep enzyme mix，上述体系置于20 ℃ 5 min，65 ℃ 5 min进行DNA修复和末端修复。完成后以60 μL AMPure XP磁珠进行纯化。Qubit 4.0定量以上纯化的核酸样本，使用基因组DNA连接试剂盒SQK-LSK109按照操作说明SOP制备测序文库。

上机测序与数据分析：取制备的测序文库74 μL加入Flowcell R9.4.1测序芯片，在MinKNOW 软件上选择5 h测序流程。用 Guppy3.2.1处理原始下机数据。获得fastq格式文件上传至EPI2Me(https://epi2me.nanoporetech.com/workflow)，以FASTQ WIMP Workflow进行宏基因组分析。

1.3.3 PCR检测 马尔尼菲青霉菌荧光定量PCR：荧光定量PCR引物及探针序列参考文献[8]，建立20 μL反应体系：Taqman qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物及探针各1 μL，DNA 1 μL，加双蒸水至20 μL。反应条件为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，并收集荧光信号，40个循环，Ct值≤35为阳性。

组织荚膜胞浆菌、利什曼原虫荧光定量PCR检测：引物及反应体系及反应条件参照文献[9-10]合成，对样本进行PCR扩增以鉴别诊断。

真菌内转录间隔区间序列(Internal Transcribed Spacer,ITS)测序分析：参照文献[11]由西安擎科公司合成真菌ITS1、ITS4通用引物；反应体系：DNA 1 μL，2×PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L ITS1及ITS4引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL；反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min、57 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，40个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物大小为500～800 bp。取上述PCR产物5 μL以QXcel Advance毛细管电泳仪检测，出现目的条带的样本，送西安擎科公司进行切胶回收纯化，双向测序。以SeqMan Pro 7.1.0拼接，所获序列上传真菌数据库(MycoBank：http://www.mycobank.org)，Similarity≥99%确定物种。

1.3.4 分离培养 取外周血200 μL，均匀涂布沙氏葡萄糖琼脂培养基，分别置25 ℃、37 ℃培养，每日观察菌落形态。取大小色泽均不同的菌落，以上述试剂盒方法提取核酸，再用上述真菌ITS序列分析鉴定菌种。

2 结 果

2.1 显微镜检 对患者外周血及骨髓以瑞氏染色，置油镜下观察，可见有深蓝色卵圆形酵母样结构，中间有横隔，核较大且浓染。如图1。

A：血涂片镜下(1 000×)；B：骨髓涂片镜下(1 000×)图1 患者血液及骨髓瑞氏染色镜下观察Fig.1 Observation of patient’s blood and bone marrow under Wright staining microscope

2.2 测序结果 本次试验所用的Flowcell是经过一次试验后清洗再次使用，有效孔为1 251，达到测序要求。根据病例样本镜检结果，实际测序时间为3.5 h，共获得Reads 84 000条，最高质量分数18.3，平均12.4，全部Reads序列长度均值7 088.7 base，最长为87 471 base，最短为562 base，总数据量为495 Mb，统计方法为Nanoplot(图2)。

纵坐标：平均的Reads质量；横坐标：整体的长度分布图2 MinION测序质量分析Fig.2 Quality analysis of MinION sequencing

宏基因组分析：将basecalling所获数据上传EPI2Me，以WIMP workflow分析，READS ANALYSED:73 433，READS CLASSIFIED:72 742，READS UNCLASSIFIED:691。产生数据中有63 617条为人类基因组数据，13条马尔尼菲青霉菌，其余有上次运行的残余Lamada噬菌体序列。通过NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)下载测序最全的马尔尼菲青霉菌基因组(GCA_003971505.1_ASM397150v1_genomic)[12]，马尔尼菲青霉菌共有8条染色体信息。本次测序数据比对上的高质量序列有6条，最长reads长度为6 089 bp，最短的为632 bp，6条序列相互覆盖，位置不重叠，其中3条位于同一条染色体CP015871.1上，如表1、图3。

图3 6条读序在马尔尼菲青霉菌基因组上的位置Fig.3 Position of the six reading sequences on the genome of Penicillium marneffei

表1 Nanopore测序数据中比对到马尔尼菲青霉菌的序列信息表Tab.1 Sequence information of Penicillium marneffei compared with Nanopore sequencing data

2.3 PCR检测结果

2.3.1 荧光定量PCR结果 PM的PCR结果为阳性。利什曼原虫荧光定量PCR结果为阴性。组织荚膜胞浆菌在600 bp左右出现条带，与目的条带不一致，应为非特异性扩增。马尔尼菲青霉菌在324 bp出现条带，如图4，经测序为PM特异性核酸序列。

2.3.2 真菌ITS测序 利用真菌ITS通用引物对患者血样DNA进行扩增，在近600 bp出现条带(图4)。双向测序拼接获得583 bp序列，上传到真菌ITS数据库Blast在线比对，鉴定为马尔尼菲青霉菌。

A1： 100bp ladder; A2/A3: 组织荚膜胞浆菌；A4/A5: 马尔尼菲青霉菌；A6/A7: 真菌ITS图4 患者血样核酸PCR扩增结果 Fig.4 Results of nucleic acid PCR amplification in patients’ blood sample

2.4 分离培养 取患者抗凝血样200 μL，接种于沙氏葡萄糖培养基，分别置25 ℃、37 ℃培养。2 d后25 ℃培养平板可见霉菌样菌落生长，37 ℃培养的平板上可见奶油色、砖红色菌落生长，7 d菌落逐渐增大，25 ℃下菌落转为黄色、白色、绿色样霉菌菌落，并产生红色素渗透至培养基，见图5。挑取色泽、形态不同的10个菌落，提取核酸，以上述ITS通用引物扩增测序，经分析比对均鉴定为马尔尼菲青霉菌。

2.5 转归 患者于2019年12月5日入住西安市传染病院。查体：T 38.5 ℃，P 130次/min，R 22次/分，BP 100/60mmHg，神志清，精神差，消瘦，睑结膜苍白，颜面部可见密集分布的米粒大小丘疹，口腔上鄂可见多个溃疡，咽后壁可见簇集样丘疹，双肺呼吸音低，未闻及干湿啰音，心率快，律齐，未闻及额外心音及杂音，腹软，全腹部无压痛、反跳痛及肌紧张，余查体未见异常。患者入院后进一步检测HIV确证试验3项均为阳性。血液淋巴细胞计数578个/μL，CD4+T淋巴细胞计数12个/μL，CD8+T淋巴计数324个/μL，CD4+/CD8+比值0.04。根据患者流行病学史、临床症状与体征及各项实验室检测结果，确诊患者为艾滋病合并马尔尼菲青霉菌病。患者入院后给予支持治疗、免疫调节治疗、抗感染治疗及抗真菌治疗。于2020年2月27日患者体温及各项检测均恢复正常，临床治愈出院。嘱出院后继续口服艾滋病抗病毒药物治疗。

A：25 ℃, 7 d可见霉菌样菌落，产红色素；B：37 ℃, 7 d可见酵母样菌落；C：25 ℃培养4倍镜下可见霉菌分枝；D: 37 ℃培养4倍镜下酵母样菌落图5 患者血液样本沙氏葡萄糖琼脂培养结果Fig.5 Results of inoculation of patient’s blood sample on Sabouraud dextrose agar

3 讨 论

一些可以引起深部感染的真菌(例如马尔尼菲青霉菌、荚膜组织胞浆菌)在形态学上与引起黑热病的利什曼原虫非常相似，它们均可侵犯单核吞噬细胞系统，寄生于巨噬细胞，致病机理与临床症状也相似，可引起发热、肝脾肿大，血常规均有三系细胞减少，此类感染性疾病经常会发生误诊。本实验室于2018年曾接诊1例疑似黑热病病例，最终诊断为出芽短梗霉菌感染[13]。本案例患者在2个医院检查骨髓片，均在镜下看到疑似利杜体,但患者利什曼原虫抗体检测为阴性，可排除黑热病。本实验室镜检发现血液中的包涵体结构与利杜体有所不同，应为酵母样细胞结构，这种细微差别一般缺乏经验的医师很难鉴别。利用宏基因测序、真菌ITS等多种分子生物学方法，并进行真菌双相分离培养均鉴定为马尔尼菲青霉菌。该患者曾有不安全同性及异性性行为史，长期从事导游行业去东南亚国家旅行，临床症状及体征符合艾滋病表现，实验室检查HIV抗体阳性。可诊断为艾滋病合并马尔尼菲青霉菌病。

3.1 马尔尼菲青霉菌感染的情况 侵袭性真菌病(Invasive fungal disease，IFD)是HIV感染进入艾滋病期的重要表现，几乎所有已发现的致病性真菌均可在艾滋病患者中引起IFD[14]。马尔尼菲青霉菌感染人类的案例最早发现于1973年[3]，该病主要流行于东南亚等国家地区，是艾滋病常见的三大机会感染之一，可做为HIV感染的重要指征[15]。中国于1982年在广西发现首例感染患者[16]，流行于广东、广西、云南、香港、台湾等省区，近年来内陆省份也相继报道了PSM病例[4]。据报道2012-2017年，中国HIV/AIDS患者的复合年均增长率为14.48%[17]，陕西省报告HIV阳性的男男同性恋人群从2008年51例增长至2017年的1 066例[18]，中国内陆省份与东南亚及沿海省区商贸旅游交往也日益频繁，无疑增加了输入性真菌感染的风险。另外，研究发现银星竹鼠、中华竹鼠、小竹鼠、大竹鼠等4种野生竹鼠可携带PM[19]，广西银星竹鼠带菌率可达到96%以上，根据分子分型研究，竹鼠携带的PM与人类感染关系密切。在这些竹鼠分布的东南亚及我国南方地区，均有人感染PM的报道，尤其HIV感染率高的地区，PM感染也较多。陕西省从未报道PSM病例，但陕西南部有中华竹鼠分布，是否带毒尚无研究资料。本案例患者为HIV感染者，老家位于陕南汉中市，又有东南亚旅行史，其感染来源有可能为输入性质。

3.2 基于宏基因组的病原微生物分析对罕见感染性疾病的鉴定 宏基因组分析技术是对患者标本所有核酸序列进行高通量测序，通过生物信息学分析，与病原菌数据库查询比对，可获得可能感染的病原体信息[6]。Nanorpore MinION测序仪小巧便携、1～2 h可完成文库构建，超长读长，可实时分析下机数据，实时反馈结果[7]。本案例构建测序文库2 h，测序3.5 h，获得Read 84 000条，最长的读长达到87 471 base。EPI2Me是Nanopore Oxford公司构建的云端在线分析系统，其中的What’s In My Pot?(WIMP) WorkFlow鉴定程序包含了RefSeq细菌、真菌及病毒数据库[20]，可将测序数据与RefSeq数据库比对进行物种的分类鉴定[21]。本案例将获得的宏基因组序列上传至EPI2Me在线分析，10 min获得比对结果，除了人类基因组外，发现有13条马尔尼菲青霉菌的序列。与NCBI下载的马尔尼菲青霉菌全基因组比对，有6条高质量序列，且互不重叠。从基因组水平证实患者血液标本中含有马尔尼菲青霉菌。在非流行区宏基因组测序技术对未知病原鉴定具有重要的指向意义。

3.3 真菌通用引物扩增无菌标本的临床诊断意义 真菌核糖体内转录区间(ITS)具有广泛的异种同源性，可用于真菌鉴定及系统发育分析。而利用真菌ITS通用引物对无菌体液进行扩增测序，也可快速鉴定真菌感染[11]，本案例从血液标本中扩增出马尔尼菲青霉菌的特异性ITS序列，利用马尔尼菲青霉菌PCR引物进行扩增也同时获得阳性结果，与宏基因组测序结果互相印证。

3.4 双相真菌培养对真菌感染最终确诊 真菌感染诊断的金标准为分离培养，致病性真菌往往具有双相培养的特性[1]，在常温下(25 ℃～28 ℃)为菌丝状生长，并可产生特定的色素，在37 ℃呈酵母样。一般认为双相产色素真菌具有一定的致病性及毒力。马尔尼菲青霉菌是所有300余种青霉菌中唯一呈双相生长的，且可产生大量的红色素[13]。在菌丝状态对人不具有感染性，而在37 ℃培养下生长的酵母状真菌具有感染性。本案例分离培养的菌落均符合以上生长特征，挑选10个不同大小形态的菌落，经ITS测序鉴定均为马尔尼菲青霉菌，从病原学上得到证实。但真菌分离培养耗时较长，可做为分子快速检测手段的最终确认证据。

本研究案例表明宏基因组测序与PCR等传统方法联合应用可提高病原诊断的特异性和敏感性，而基于纳米孔测序技术的宏基因组分析对现场快速鉴定未知病原体具有重要的意义。但纳米孔测序准确性仍有待提高，成本也相对较高，本案例中使用不同的生物信息学分析方法及病原数据库分析得到的结果也有一定的差异，检测方法还需要进一步标准化。需要结合流行病学、临床症状体征及其它实验室方法来互相印证评估。