内蒙古大兴安岭林区牙克石段的蜱种及蜱携病原体感染调查

刘 丹，乌兰图雅，殷旭红，崔云虹，王亭富，阿木日汗，曹民治，王国栋，闫大成,李纯浦,高娃

蜱媒传染病是由蜱作为传播媒介而引发的一类自然疫源性疾病。蜱是一种吸血寄生虫，它不但可以游离存活在自然界内，还可以寄生于牛、羊、马、骆驼、鼠等动物体内或体表。蜱可感染、传播的病原体种类多、范围广，而且一种蜱可同时携带2种或2种以上的病原体[1]。许多病原体能经卵、经期传递，使蜱成为贮存宿主和传播媒介。近年来，蜱媒传染病暴发在世界各地频发，严重影响到畜牧业的发展，给居民的健康带来极大的挑战，越来越受到国内外学者的广泛关注[2-4]。

内蒙古东部大兴安岭林区位于中国东北部，与俄罗斯相邻，拥有我国最大的天然草原区，作为我国重要的林牧业基地之一，植被覆盖率较高。得天独厚的自然环境，使得野生动物资源丰富，加之大量家畜牧养，促进了蜱的生长、繁殖。既往研究曾从内蒙古东部草原的蜱样本中检出多种病原体[5-6]。牙克石段作为大兴安岭林区的重要组成部分，人的蜱传莱姆病和森林脑炎发病率较高，近年又在该地发现另一种蜱传疾病——埃立克体病，其在牙克石地区发病率为14.77%[7]。本研究在大兴安岭林区牙克石段采集蜱样本，分析大兴安岭林区牙克石段的蜱种、蜱携带病原体种类及复合感染，为该地区预防和控制蜱传病原体感染提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究区域 大兴安岭林区牙克石段即牙克石市，它是呼伦贝尔市下辖13个县级市之一，位于内蒙古东北部(北纬47°39′～50°21′，东经120°28′～122°29′)、大兴安岭中脊中段西坡。市域沿大兴安岭主脉南北分布，平均海拔600余米，属大陆性寒温带气候特征，年平均气温-1 ℃～-5 ℃。野生动物资源丰富，因而使其成为蜱类栖息的良好孳生地。

1.2 标本采集与分类 2016-2019年，在东部林区蜱活跃高峰期(5-6月)采用布旗法采集游离蜱标本，记录采集时间、地点、方法、寄主等信息。

1.3 蜱虫的解剖和DNA提取 采集到的蜱虫标本使用次磷酸钠和75%的乙醇加碘伏，浸泡5 min，消毒后用无菌水清洗自然干燥。利用体视显微镜逐一进行解剖，摘出唾液腺保存于PBS溶液，并使用QIAamp DNA Mini Kit进行DNA提取，按照说明书操作，提取出来的DNA保存于-20 ℃。

1.4 蜱种的分类与鉴定 将采集到的标本使用体视显微镜进行形态学初分类。然后对蜱DNA样本进行PCR扩增，再对扩得的DNA片段测序，最后通过在线BLAST将测得DNA序列与GenBank基因序列比对来确定蜱的种类。

1.5 特异性基因分析 采用灵敏度和特异度较高的靶基因检测蜱中可能存在的多种病原体。斑点热立克次体的检测先采用gltA基因进行初筛，将gltA初筛阳性样品分类，再选择代表性样品扩增合rOmpA基因进行确认。埃立克体属以omp1、无形体属以msp2、莱姆病螺旋体以flaB、新型回归热螺旋体以glpQ作为靶基因进行PCR扩增。PCR反应体系均使用Blend Tag-Plus，按照说明书操作。PCR扩增中使用的各种特异性引物均由南京金斯瑞生物科技公司合成，见表1。

表1 特异性PCR引物设计Tab.1 Specific PCR primer design

1.6 统计学分析 采用Excel建立数据库，SPSS 19.0进行数据分析。计数资料采用例数(百分比)来描述，率的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同地区常见蜱种及所处生态景观分布 大兴安岭林区牙克石段共采集蜱虫2 786只，雄蜱1 413只(50.7%)，雌蜱1 373只(49.3%)；幼蜱83只(3.0%)，若蜱125只(4.5%)，成蜱2 578只(92.5%)。通过体视显微镜观察和基因分析，隶属于1科3属4种，分别为全沟硬蜱2 191只(78.6%)、嗜群血蜱442只(15.9%)、日本血蜱133只(4.8%)、森林革蜱20只(0.7%)，全沟硬蜱、嗜群血蜱为本地区的优势蜱种。其中，全沟硬蜱分布于所有地区，嗜群血蜱和日本血蜱的分布也较广泛，森林革蜱仅在3个地区分布。在所调查的区域内，常见生境均以原始的棕色针叶森林为主，仅乌奴耳镇(70.6%，211/299)和绰河源镇(51.1%，95/186)以嗜群血蜱居多之外，其他地区均以全沟硬蜱居多，见表2。

表2 牙克石市不同地理区划中常见蜱种所处生态景观分布Tab.2 Ecological landscape distribution of common tick species in geographic divisions of Yakeshi City

2.2 不同地区蜱携带病原体种类 在大兴安岭林区牙克石段的7个采样地区的蜱中，斑点热立克次体检出率较高的为乌奴耳镇和绰河源镇，分别为74.2%(222/299)和48.4%(90/186)；无形体属检出率较高的有博克图镇(18.9%，39/206)、免渡河镇(14.6%，183/1 256)、乌奴耳镇(13.0%，39/299)和乌尔其汉镇(10.8%，72/669)；埃立克体属检出率较高的为库都尔镇和免渡河镇，分别为26.1%(12/46)和13.1%(164/1 256)；莱姆病螺旋体总检出率为42.9%(1 195/2 786)，其中库都尔镇(76.1%，35/46)、博克图镇(54.9%，113/206)、乌奴耳镇(49.8%，149/299)和免渡河镇(44.7%，561/1 256)的检出率均超过平均水平；新型回归热螺旋体的检出率较高的为库都尔镇和乌奴耳镇，分别为13.0%(6/46)和10.0%(30/299)，见表3。

表3 不同地区蜱携带病原体情况Tab.3 Pathogens carried by ticks in different regions

2.3 不同特征蜱携带病原体情况 在检出的4种蜱中，斑点热立克次体检出率最高的蜱种为嗜群血蜱(66.5%，294/442)，检出率最低的为全沟硬蜱(2.8%，61/2 191)(χ2=993.756，P<0.001)；无形体属检出率较高的为全沟硬蜱(13.5%，296/2 191)和嗜群血蜱(10.4%，46/442)，森林革蜱未检出无形体(χ2=27.679，P<0.001)；埃立克体属检出率最高的为全沟硬蜱(11.2%，245/2 191)，森林革蜱未检出埃立克体(χ2=17.586，P<0.001)；莱姆病螺旋体检出率较高的为全沟硬蜱(44.6%，977/2 191)和嗜群血蜱(42.3%，187/442)(χ2=34.895，P<0.001)；新型回归热螺旋体检出率较高的是森林革蜱，为(10.0%，2/20)，日本血蜱未检出该病原体(χ2=21.814，P<0.001)，见表4。

成蜱的无形体属检出率(13.2%)高于若蜱(3.2%)(χ2=23.149,P<0.001)；成蜱的莱姆病螺旋体检出率(44.3%)高于幼蜱(7.2%)(χ2=46.606，P<0.001)，成蜱、若蜱、幼蜱的新型回归热螺旋体检出率分别为5.1%、4.8%、1.2%，差异无统计学意义(χ2=2.61，P=0.271)。见表4。

表4 不同特征蜱携带病原体情况Tab.4 Pathogens carried by ticks with different characteristics

2.4 不同地区蜱携病原体的复合感染 大兴安岭林区牙克石段蜱的复合感染率为19.5%(544/2 786)。双重复合感染率为16.4%(458/2 786)，其中斑点热立克次体和莱姆病螺旋体复合感染率最高，为7.1%(197/2 786)。蜱的双重复合感染率最高的地区是免渡河镇，为40.6%(186/458)；伊图里河镇最低，为1.3%(6/458)。蜱的多重复合率为3.1%(86/2 786)。乌奴耳镇是3种病原体复合感染率最高的地区，为47.4%(36/76)。仅乌奴耳镇(90%，9/10)和绰河源镇(10%，1/10)的蜱存在4种病原体的复合感染，见图1。

图1 不同地区复合感染率构成Fig.1 Composition of multiple infections in different regions

3 讨 论

大兴安岭林区牙克石段地处内蒙古东部大兴安岭林区中心区域，有丰富的蜱资源，且蜱叮咬事件和蜱媒莱姆病或森林脑炎在该地区发生较多。但是，由于缺乏认识，使得一些被蜱叮咬的发热病例得不到进一步实验室确认，误诊及漏诊十分普遍，因此研究该地区蜱携病原体感染状况十分必要。

全沟硬蜱在内蒙古东部林区的分布最为广泛，生境主要是棕色针叶森林，为该地区主要的优势蜱种，与秦文浩等[7]的研究结果相似。全沟硬蜱在北方针阔混交林带大量分布，在我国的新疆、内蒙古以及东北3省、河北省北部等地区均为优势蜱种[11-13]。

本次PCR检测结果显示，大兴安岭林区牙克石段蜱的莱姆病螺旋体感染率相对较高，与万康林等[14]的研究结果相似。不同乡镇蜱携带病原体差异较大。乌奴耳镇蜱的斑点热立克次体和无形体的感染率相对较高，而库都尔镇蜱的埃立克体、莱姆病螺旋体和新型回归热螺旋体的感染率相对较高。因此，要因地制宜，根据不同地区蜱携病原体的种类和水平制定相应的应对措施。

不同蜱种携带的蜱媒病原体差异很大。嗜群血蜱的斑点热立克次体感染率相对较高，与吴琼等[15]的研究结果一致；全沟硬蜱的无形体、埃立克体和莱姆病螺旋体的感染率相对较高；森林革蜱的新回归热螺旋体感染率较高，这可能与蜱种及其宿主的特异性相互作用有关，也可能是病原体感染敏感性存在蜱种属特异性[6]。本研究显示雄性蜱携带病原体高于雌性，与国内外的研究结果一致[16-17]。另外，成蜱的病原体感染率高于幼蜱。这可能是由于多数蜱类在其发育期间需要更换宿主，成虫被病原体感染几率高于幼虫。另外，某些病原菌可经卵传播，蜱可以将病原菌传递给下一代，而无形体和埃立克体例外，二者均不能垂直传播，故幼蜱中检测不到该病原体。

大兴安岭林区牙克石段的蜱携多种病原体复合感染率为19.5%，高于俄罗斯某地报道(12.4%)[18]。以往发表的文献已证实，复合感染在莱姆病中多见[19]。本研究发现，蜱的莱姆病螺旋体和斑点热立克次体复合感染率为7.1%，同时莱姆病螺旋体和埃立克体或无形体复合感染率均为5.3%，介于以往美国调查结果(3%～26%)[20-21]。病原体复合感染在全沟硬蜱中较普遍，国内外学者均在全沟硬蜱中同时检测到2种或以上的病原体[12-13,22-23]，本研究显示全沟硬蜱复合2种及以上病原体的感染率为14.6%(319/2 191)。全沟硬蜱是典型的3宿主蜱，完成一个生命周期需经过卵、幼蜱、若蜱和成蜱4个不同的阶段[5]。全沟硬蜱自卵孵化后，一般需要多次更换宿主才能完成饱血过程，这极大地增加了该蜱被脊椎动物携带的几率，也增加了其携带病原体的种类。免渡河镇和乌奴耳镇的蜱普遍携带多种病原体，需重点加强该地区蜱媒传染病的监测和预防。

本研究所采集的东部林区范围相对较窄，较为局限。此外，仅用布旗法采集了林区的游离蜱，缺乏不同采集方法及不同宿主对蜱种及分布特征影响等方面的资料。在后续的研究中，我们会逐渐扩大样本采集范围、增加不同寄生宿主蜱的采集，更深入的挖掘不同宿主、不同生境对蜱携病菌种类的影响。另一方面，我们在病原体的进一步分型中，遇到困难，目前课题组正在努力处理，序列分析结果未能呈现。