基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌

谢 辉，周 蕾，祁芝珍，邵高祥

鼠疫是由鼠疫菌感染所引起的一种自然疫源性疾病，能通过呼吸道直接接触传播，引起人间疫情暴发流行。快速有效的诊断技术是控制鼠疫疫情的关键，鼠疫菌传统诊断方法主要有细菌培养及鼠疫反向血凝试验，在鼠疫监测和疫源地调查中使用频率高，特异性较强，但操作复杂且耗时，易延误疫情判定。本研究是基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR诊断方法，首先是建立荧光定量PCR(探针)诊断方法以快速准确检测鼠疫菌，其次将荧光定量PCR检测试剂(引物、酶、dNTP)预混冻干，彻底摆脱冷链运输和冷藏保存，从而制备一种能够在室温(25 ℃)稳定保存的试剂，使用时仅需将待测核酸溶液与预混试剂简单混合(试剂可瞬间崩解)即可上机检测，大大简化了操作流程，降低了外源污染的可能性。这种基于室温长期储存的核酸检测预混体系的荧光定量PCR检测方法，适合鼠疫疫源地监测以及流行病学现场调查，为鼠疫的预防和控制提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试剂及仪器 核酸检测试剂(探针法)由北京磐创精准有限公司提供；中国细菌浊度标准管(批号2020-1)由中国药品生物制品检定所提供；荧光定量 PCR扩增仪购于鲲鹏基因(北京)科技有限责任公司。

1.1.2 实验菌株 测试菌株：55株鼠疫耶尔森菌菌株是分别从11个鼠疫自然疫源地不同宿主动物分离获得的代表株；减毒菌株EV76由鼠疫菌专业实验室提供。对照菌株：假结核耶尔森氏菌15种血清型，由鼠疫菌专业实验室提供。见表1。

表1 荧光定量PCR冻干试剂检测试验菌株的结果Tab.1 Detection of the test strain with fluorescence quantitative PCR lyophilized reagent

1.2 方 法

1.2.1 菌株培养及模板制备 将选取的55株野生鼠疫耶尔森氏菌菌株、减毒菌株EV76及15种血清型假结核耶尔森氏菌培养于1%溶血赫氏培养基，经28 ℃孵育24 h，取细菌培养物加入0.5 mL灭菌纯水制成菌悬液， 100 ℃加热10 min灭活后离心(12 000 r/min，2 min)，取上清作为DNA模板，其中减毒菌株EV76模板作为阳性质控模板。

1.2.2 荧光定量PCR检测法

1.2.2.1 引物的设计与合成 引物合成根据NCBI数据库(GenBank登录号AF350075)公布的鼠疫耶尔森菌3a基因序列，由北京磐创精准有限公司合成：

Y3a1：5′-TGTAGCCGCTAAGCACTACCATCC-3′；

Y3a2：5′-GGCAACAGCTCAACACCTTTGG-3′。

1.2.2.2 鼠疫菌模板的制备 参照1.2.1取上清作为DNA模板。

1.2.2.3 基于核酸预混室温储运技术荧光定量扩增反应的优化 以不同退火温度(60～65 ℃)进行荧光定量扩增反应，选择最佳退火温度。

1.2.2.4 基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR检测方法 反应体系及扩增和循环条件：反应体系20 μL，取制备的各菌株模板19 μL加入冻干试剂(1 μL)进行溶解，同时用EV菌模板作为阳性对照，用灭菌去离子水作为阴性对照，用优化扩增条件进行荧光定量PCR扩增：42 ℃ 1 min，95 ℃预变性5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃退火延伸30 s，45个循环；40 ℃保温 60 s，结束后进行荧光信号采集，根据荧光信号循环(Ct)来判断扩增结果，Ct值<35判为阳性。

灵敏度试验：根据比浊法测定鼠疫耶尔森菌EV76菌液浓度，将菌液从106CFU/mL以10倍倍比稀释至1.0×102CFU/mL，取各浓度菌液制备模板(方法同1.2.1)用于荧光定量PCR扩增。

特异性试验：将制备的55株野生鼠疫菌菌株模板、假结核耶尔森氏菌15种血清型进行荧光定量扩增，验证其特异性。

冻干试剂的保存期试验：将试剂分别放置于25 ℃、37 ℃，保存不同时间，定期进行敏感性检测，考察不同时间、温度条件下该试剂的稳定性。

2 结 果

2.1 基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR退火温度的优化结果 以鼠疫EV菌为模板，在不同退火时间、不同退火温度下的试验结果显示，反应条件退火温度为60 ℃时，对EV菌株的检测信号值最强，Ct值最小。

2.2 基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR标准曲线的构建 以鼠疫耶尔森氏菌EV为荧光定量PCR反应标准品，以比浊法测定菌液浓度稀释至1×106CFU/mL，再以灭菌纯水10倍稀释至1×10 CFU/mL，取各浓度菌液提取核酸进行荧光定量PCR检测，检测所得各个标准品的Ct值，荧光定量PCR仪自动生成标准曲线，见图1所示。

图1 鼠疫耶尔森氏菌核酸预混冻干试剂检测标准曲线Fig.1 Standard curve of Yersinia pestis detection with nucleic acid premix lyophilized reagent

2.3 基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR敏感性检测 通过对鼠疫菌悬液10倍系列稀释后制备模板，按照1.2.2进行荧光定量检测，结果显示基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR敏感性达到102CFU/mL，如图2所示。

2.4 基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR特异性检测 将提取的我国11个疫源地野生鼠疫耶尔森菌55株作为模板进行荧光定量PCR扩增，结果显示，55株野生鼠疫菌检测为阳性，与鼠疫菌近源的假结核耶尔森菌15种血清型检测为阴性(图3)，说明研制的核酸预混冻干试剂具有较好的特异性。

a～k为我国11块疫源地野生鼠疫菌代表菌株的扩增曲线；l为假结核耶尔森菌代表菌株；m为阴性对照图3 鼠疫耶尔森氏菌核酸预混冻干试剂特异性试验Fig.3 Specificity test of Yersinia pestis detection with nucleic acid premix lyophilized reagent

2.5 基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR检测冻干试剂的保存期试验 结果显示核酸预混冻干试剂置于25 ℃、37 ℃保存180 d后检测其敏感性，与对照温度(0 ℃)相比无差异，检测下限均为1×102CFU/mL。见表2。

表2 荧光定量PCR冻干试剂不同保存条件的敏感性(Ct值)Tab.2 Sensitivity of the fluorescence quantitative PCR lyophilized reagent under different preservation conditions (Ct value)

3 讨 论

我国是鼠疫自然疫源地分布广泛、结构高度复杂的国家，到目前为止已有11块鼠疫疫源地[1]，为防止鼠疫从疫源地向人类传播，我国针对鼠疫疫源地采取多种监测措施[2]，而能够提高监测效力的措施，防止疫源地动物疫情波及人间，最关键技术环节就是建立实用性鼠疫菌检测的实验室诊断方法。目前在鼠疫疫源地监测主要依靠细菌培养及鼠疫反向血凝试验，这些方法在过去几十年里为鼠疫菌诊断发挥了重大作用，但因其敏感性差、检测时间滞后不能满足快速诊断的需要[3]。现行的鼠疫诊断标准[4]将聚合酶链式反应(PCR)纳入其中，大大促进了鼠疫菌检测技术的发展，但存在操作步骤复杂、易引起核酸污染而出现假阳性、无法定量分析等不足，尤其是鼠疫疫源地在偏远地区而PCR试剂的运输、储存及现场应用均在低温条件下进行，导致检测鼠疫菌PCR技术不能较好发挥作用。为解决实际问题，1995年出现的针对PCR实际应用需要室温保存试剂的研究[5-6]，因能克服上述缺点，已有学者将其应用于病原体检测[7]。本项目是在上述研究成果上通过依托经典、可靠的荧光定量PCR技术为基础，将全体系预混室温储存技术应用于野外监测时鼠疫菌的检测。

基于全体系预混室温储存技术荧光定量PCR方法的工作原理，是将荧光定量PCR反应体系中的酶、引物、探针、dNTP预先混合后进行引物探针优化设计，加入既能保护核酸试剂的活性又可为试剂复溶提供赋形与崩解的稳定剂，通过采用热干燥、冷冻干燥等不同干燥工艺和不同工艺参数分别对支撑体系进行干燥，研制成全预混体系可室温储存的冻干试剂。本研究正是应用已研制的冻干检测试剂，只需加入样品模板，置于荧光定量PCR分析仪检测鼠疫菌，通过分析软件直观记录整个PCR过程，一步式加样使操作过程简便化，避免核酸污染和操作时的人为误差。为考察该技术是否适合检测我国各鼠疫疫源地菌株，本试验选取我国11块鼠疫疫源地55株野生菌代表菌株及与鼠疫菌近源的耶尔森氏菌属中的假结核耶尔森氏菌15种血清型，进行荧光定量PCR扩增。实验结果显示，基于全体系预混室温储存技术的荧光定量PCR冻干试剂的敏感性为102CFU/mL，这与文献报道的普通PCR(敏感性为102CFU /mL)相同[8]。特异性结果表明我国11个疫源地的野生鼠疫菌扩增均为阳性，假结核耶尔森菌15种血清型扩增均为阴性，验证该技术具有良好特异性。冻干试剂在25 ℃(室温)以及37 ℃(高温)条件下保存180 d，敏感性与冷冻保存的试剂无差异，利用标准曲线可得出鼠疫耶尔森氏菌定量结果。

本研究对该检测方法的应用进行了初步研究，首次应用本检测方法检测我国各疫源地的鼠疫耶尔森氏菌，该方法具有敏感性高、特异性强、可量化的特点，为研制诊断试剂盒奠定了基础；全预混的冻干试剂可室温储存、运输，试验操作便捷快速，实现了实验室精准技术在鼠疫野外现场条件下的广泛使用。