102株侵袭性肺炎链球菌血清型分布特征及耐药谱分析

任红宇，王艳晴，李一楠，赵 娜，秦 天

肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia，Sp)所致肺炎是社区获得性肺炎之一,占社区获得性肺炎的15%，致死率可达25%[1-3]。轻者导致细菌性肺炎，严重时可发展为菌血症和细菌性脑膜炎[4]。全球范围内，每年估计由肺炎链球菌引起的脑膜炎病例大约为32 500例、菌血症637 000例、肺炎2 000万例，5岁以下儿童死亡原因中，肺炎占15%[5-6]。虽然肺炎链球菌可分为46个血清群、90多个血清型，但只有其中的20多个血清群/型可以导致疾病[7-8]，要准确鉴定肺炎链球菌的群/型别才能及时确定治疗方案[9]。目前用于预防由这些血清群/型引起的感染有如下几种疫苗：分别是肺炎链球菌23价多糖疫苗(PPV23)、10价结合疫苗(PCV10)、7价结合疫苗(PCV7)、13价结合疫苗(PCV13)[10-12]。因为疫苗的推广、应用、研发以及抗生素的规范使用是基于临床分离株不断监测的基础上的，且肺炎球菌的血清群/型会随着时间的推移而变化[13]。因此，监测侵袭性肺炎链球菌的血清群/型以及耐药谱特性显得尤为重要。本研究以临床患者不同类型样本为实验对象进行血清分群/型，同时，对102株侵袭性肺炎链球菌进行24种抗生素敏感性检测，旨在了解来源于不同标本类型侵袭性肺炎链球菌血清群/型的分布情况以及耐药特性，从而更好地指导疫苗使用和临床用药。

1 材料与方法

1.1 实验菌株 从中国CDC传染病所呼吸道传染病室菌株库中，选取2011-2014年分离自临床病人的102株菌株。分别是内蒙古26株(血液分离株22株、胸水分离株4株)；宁夏20株(血液分离株12株、脑脊液分离株6株、胸水分离株1株、穿刺液分离株1株)；四川省19株及辽宁省37株均来自血液分离株。

1.2 主要试剂和仪器 PCR扩增仪为美国 BIO-RADPT-200，凝胶成像系统为美国Bio-Rad Geldoc XR，TaqDNA聚合酶、dNTPs、100 bp DNAMarker均购自大连宝生物TaKaRa公司，超纯水购自美国Gibical公司，DNA提取试剂盒购自德国QIAGEN公司，血清分型试剂盒PNEUMOTEST购自丹麦血清学研究所(Statens Serum Institute，SSI)，显微镜购自日本奥林巴斯公司，细菌比浊仪购自美国BD公司，药敏板和全自动药敏分析仪均购自山东鑫科生物科技股份有限公司，二氧化碳孵箱购自日本三洋公司，PCR引物由诺和公司合成，细菌生长培养基购自OXICD公司。

1.3 实验方法

1.3.1 采用PCR方法进行初步鉴定 如下表所示引物序列基于荚膜合成基因簇来控制所有血清群/型荚膜合成，从而进行不同的血清群/型分型组合[14-16]。该方法包含8个多重PCR扩增反应，分别是：①6、3、19A、22A/F； ②8、33F/A/37、15A/15/F、7F/7A/、23A; ③19F、12F/12A/44/46、11A/11D；④24A/24B/24F、7C/7B/40、4、18、9V/9A；⑤14、1、23F、15B/15C、10A；⑥39、10F/10C/、33C、5；⑦23B、35A/35C/42、34、9N/9L、31；⑧21、2、20、13。每个多重PCR反应中各包含4～5对分群/型引物以及鉴定肺炎链球菌种的引物CPS。扩增体系是25 μL/个反应；扩增条件是95 ℃ 15 min；94 ℃ 30 s、54 ℃ 90 s、72 ℃ 60 s (30个循环)；72 ℃ 10 min。将扩增产物于2%琼脂糖凝胶(含DNA染料4 μL/100 mL，100 V电泳80 min。同时加100 bp marker以判断结果。未包含在扩增体系中的血清型17A直接进行血清分型。见表1。

表1 肺炎链球菌血清型分型引物序列Tab.1 Primer sequence for serotyping of Streptococcus pneumoniae

1.3.2 血清分群/型 全部菌株接种于哥伦比亚血琼脂培养基上，置5% CO2培养箱中培养18 h。用无菌棉签刮取新鲜培养的细菌，溶于0.85%的NaCl溶液中，比浊3.0麦氏单位菌悬液。分别吸取分群/型血清、菌悬液和1%甲基兰溶液各5 μL于载玻片上，混合均匀，盖上盖玻片，100X油镜下观察试验结果。如果荚膜涨起(菌体自身肿胀)、菌体周围可见边界清晰的无色环状物，为阳性试验结果。采用该方法对全部分离菌株进行血清分群/型实验[17]。

1.3.3 耐药检测 细菌培养及浓度测定：用棉拭子刮取适量新鲜培养的细菌于细菌稀释液中，测定和调整比浊值为0.5麦氏单位(Mc Farland)。取50μL 该细菌菌悬液于12mL药敏接种培养液中进行稀释并混匀，自动加样器各取100 μL分别加入药敏培养板各孔。该培养板包括3组抗生素：A组(常规、首选实验的抗菌药物)有红霉素、复方新诺明、克林霉素、青霉素口服、青霉素注射剂、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素；B组(首选实验但选择性报告的抗菌药物)有头孢曲松、美罗培南、头孢噻肟、头孢吡肟、四环素、莫西沙星、左氧氟沙星、万古霉素、多西环素、吉米杀星；C组(替代性或补充性抗菌药物)有利福平、阿莫西林/克拉维酸、头孢呋辛(注射)、头孢呋辛(口服)、利奈唑胺、氯霉素。37 ℃ 5% CO2孵箱孵育18 h判读结果。每次实验分别用大肠埃希菌ATCC25922和肺炎链球菌ATCC49619对药敏接种培养液做质控、质量检测。

2 结 果

2.1 102株侵袭性Sp血清分群/型结果 其中96株(94.12%)通过PCR法鉴定出血清群/型，6株(5.88%)通过荚膜肿胀实验鉴定出明确的血清群/型。共分成21个血清群，包括19、6、14、23、35/42、34、3、22、15、1、18、4、5、7、8、10、11、13、17、20、33。尽管其中的18个血清群为23价肺炎链球菌多糖疫苗(PPV23)所覆盖，但这18个血清群中包含的血清型如6A(3株)、6C(4株)、6D(4株)、15C(1株)、23B(2株)、22A(4株)、18A(1株)、18F(1株)、7B(1株)、17A(1株)未在23价疫苗之列；另外还有35/42群(6株)、34群(5株)、13群(1株)3个血清群也是23价疫苗没有覆盖到的。23价疫苗以外血清群/型合计33株，占总株数的32.35%。全部实验用菌株中主要流行血清群依次为(前3位)：血清群19(26.47%)、血清群6(17.65%)、血清群14(14.71%)，占总株数的58.83%。且35/42群、34群排在21个血清群中的第5位和第6位。见表2。

表2 102株Sp血清群分布结果Tab.2 Serogrouping results of 102 Sp strains

2.2 不同标本类型血清分群/型结果 102株菌株来源于血液、脑脊液、胸水和穿刺液4种标本类型。其中90株分离自血液，分成18个血清群；另3种类型标本共分离到12株菌株，鉴定出8个群。见表3。

表3 不同分离部位102株侵袭性SP血清分型结果Tab.3 Serotyping results of 102 SP strains isolated from different sites

2.3 102株侵袭性Sp耐药结果 耐药率从高到低依次为：阿奇霉素、地红霉素、克拉霉素、红霉素、四环素、克林霉素、复方新诺明、头孢呋辛(注射)、头孢呋辛(口服)、青霉素(口服)、氯霉素、头孢塞肟、青霉素(注射)、万古霉素、利奈唑胺、美罗培南、利福平、左氧氟沙星、阿莫西林/克拉维酸、头孢吡肟、莫西沙星、头孢曲松、多西环素、吉米沙星。耐药率在90%以上的是阿奇霉素、地红霉素、克拉霉素、红霉素；耐药率在50%以上的是四环素、克林霉素、复方新诺明；耐药率在10%～50%之间的是头孢呋辛(注射)、头孢呋辛(口服)、青霉素(口服)、氯霉素、头孢塞肟；耐药率在10%以下的是青霉素(注射)、万古霉素、利奈唑胺、美罗培南、利福平、左氧氟沙星、阿莫西林/克拉维酸、头孢吡肟；耐药率为0的是莫西沙星、头孢曲松、多西环素、吉米沙星。见表4。

表4 102株侵袭性Sp对24种抗生素耐药结果Tab.4 Resistance of 102 invasive Sp strains to 24 antibiotics

3 讨 论

肺炎链球菌可经呼吸道进行自体转移,也可经飞沫、分泌物传播,主要危害人群为儿童和老年人,尤其是婴幼儿。在机体免疫力减弱时,被感染者发生浸润感染,引起鼻窦炎、肺炎、脑膜炎、中耳炎等严重侵袭性疾病。本研究选用的102株肺炎链球菌分离自临床患者血液、脑脊液、胸水、穿刺液等，属于侵袭性菌株[18]。 结合EUCAST和临床推荐对24种抗生素进行敏感性检测[19]。3组耐药数据表明，耐药率<10%的A组只有青霉素注射剂(5.88%)1种抗生素；B组有吉米沙星(0%)、多西环素(0%)、莫西沙星(0%)、头孢曲松(0%)、头孢吡肟(1.96%)、左氧氟沙星(2.94%)、美罗培南(3.92%)、万古霉素(5.88%) 8种抗生素；C组有利福平(2.94%)、阿莫西林/克拉维酸(1.96%)、利奈唑胺(3.92%)3种抗生素。由此可见，在治疗由侵袭性Sp引起的感染时上述11种抗生素可以选用。

研究Sp血清分群/型对于合理指导临床用药意义重大,目前全世界已发现46个血清群,90 多个血清型,而其中与肺炎链球菌疫苗相关的仅有20余种[20-21]。研究102株侵袭性Sp分成21个血清群。其中含10株以上的血清群是19群(27株)、6群(19株)、14群(14株) ,合计60株，占到总实验株数的58.82%。与高占成等研究结果一致[22]。我们推测上述3个血清群应是我国的优势血清群。

来源于血液标本的菌株分成18个血清群，来源于脑脊液、胸水等标本的菌株分成8个血清群。不同类型标本血清群不完全相同。血液中分离的血清群以6群、19群和23群为主，而脑脊液中分离的血清群/型除了包含在血液中分离的血清型别外，还有如33群、18F血清型、7B血清型等独有的型别。这些血清群/型都不在23价疫苗覆盖范围。此外，6群19株菌株共分成A、B、C、D 4个血清型，其中3个血清型(6A、6C、6D)未在23价疫苗覆盖范围之内，占6群的57.89%(11/19)。另外，13、34、35/42 血清群也未在疫苗覆盖范围，它们分别来源于血液的13血清群(1株)，34血清群(4株)、35/42血清群(6株)以及来源于胸水的34血清群(1株)。综上所述，分离自不同类型标本的血清群/型未完全覆盖在23价疫苗中。所以笔者认为应加大脑脊液、胸水等标本的监测，以充分了解血清群/型分布及其变化，为研发新的更多种的疫苗提供数据。

Sp的耐药形势十分严峻，特别是多重耐药现象。要综合考虑患者病情及其本地区肺炎链球菌血清分布与耐药性情况，同时，在条件许可下尽量根据细菌培养与药敏试验结果来合理使用抗生素。尽管中国在2017年引入了PCV13，但疫苗接种率仍然很低。在我们处理肺炎链球菌引起的感染性疾病时，应重点关注增加肺炎球菌疫苗的接种率、减少抗生素的不当使用，有针对性地进行预防。