草乌甲素通过JAK2/STAT3通路抑制Nav1.6表达减轻奥沙利铂诱发的神经病理性疼痛*

刘高丽， 刘 静， 王江栓， 吴 松

（1漯河医学高等专科学校医学检验技术教研室，河南漯河 462002；2郑州大学附属郑州中心医院重症监护室，河南郑州 450000；3漯河医学高等专科学校人体解剖学教研室，河南漯河 462002；4漯河医学高等专科学校计算机教研室，河南漯河 462002）

奥沙利铂（oxaliplatin，OXA）为用于肿瘤化疗的第三代铂类抗肿瘤药物，对晚期和/或转移性消化道肿瘤等均具有较好疗效［1］。随着临床广泛的应用，神经病理性疼痛（neuropathic pain，NP）被发现为其主要局限性并发症，导致部分患者不得不终止治疗，影响患者生活质量［2］。由于对OXA 引起NP 的机制缺乏深入了解，因此目前尚缺乏针对性的治疗。草乌甲素（bulleyaconitine A，BLA）为分离自乌头（Aconitum bulleyanumDiels）根茎中的萜类生物碱，为我国自主研发的有效镇痛剂，临床已用于治疗风湿和类风湿性关节炎、腰肌劳损等引起的慢性疼痛［3］。研究发现，BLA 可降低辣椒素受体瞬时受体电位香草酸1 型（transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1）的表达和神经元凋亡，减轻神经机械损伤所致的NP［4］。另有研究显示，草乌甲素可减轻紫杉醇引起的NP，但未对其作用机制进行探讨［5］，而其对OXA所致NP的治疗效果及作用机制均不清楚。

Janus激酶（Janus kinase，JAK）/信号转导和转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信号通路可通过作用于多种蛋白而调节细胞增殖、分化、免疫和炎症等生物学过程［6］。JAK2及其底物STAT3 主要分布在神经系统中，可调节多种神经递质受体和离子通道蛋白的表达，其过度活化与大鼠NP 症状同步，抑制其活化可作为治疗NP的新靶点［7-8］。在骨癌相关疼痛模型中，JAK2/STAT3信号通路的活化可上调电压门控钠通道（voltagegated sodium channels，Nav）等通道蛋白表达，增强背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）神经元兴奋性，引起疼痛的发生［9］。Li 等［10］研究发现，Nav1.6 在DRG 中高表达参与OXA 所致大鼠NP 的病理过程。本研究推测BLA 可能通过作用于JAK2/STAT3 通路调控Nav1.6 表达，进而减轻OXA 诱发的NP，并通过建立OXA诱导的大鼠NP模型对此进行研究。

材 料 和 方 法

1 实验动物

成年雄性SPF 级Wistar 大鼠（200～220 g），购自河南省实验动物中心，许可证号为SCXK（豫）2017-0001。大鼠均在本校动物实验中心的动物房中常规饲养，适应1周后开始实验。

2 主要试剂及仪器

BLA 购自云南昊邦制药公司；注射用奥沙利铂购自齐鲁制药公司；JAK3 激动剂C-A1 购自MedChemExpress；抗JAK2 和p-JAK2 单克隆（兔）抗体及羊抗兔Ⅱ抗购自CST；抗Nav1.6 多克隆（兔）及STAT3和p-STAT3单克隆抗体购自Abcam；BCA蛋白定量试剂盒和ECL 发光试剂盒购自Thermo；RNA TriPure 试剂、反转录和FastStart™PCR Master 定量PCR 试剂盒购自Roche。Western blot 实验装置购自BioRad；定量荧光PCR 仪购自Roche；膜片钳放大器购自HEKA。

3 方法

3.1 模型制备和分组 大鼠分别于第1、2、7、8、14、15、21 和22 天，每天腹腔注射1 次OXA（4 mg/kg），制备OXA诱发的NP模型，对照组大鼠相同时间注射等量5%葡萄糖注射液［11］。首先，为明确BLA 对OXA大鼠的治疗作用，将模型大鼠分为OXA 组及0.04 mg/kg、0.12 mg/kg和0.36 mg/kg BLA 治疗组，并设置对照组，每组8 只。然后，为明确JAK2/STAT3 信号通路在BLA 治疗过程中所发挥的作用，给予0.36 mg/kg BLA 治疗的OXA 大鼠同时注射JAK3 激动剂C-A1，组别设置为OXA组、0.36 mg/kg BLA治疗组和0.36 mg/kg BLA 及C-A1 合用治疗组，每组8 只。在OXA 诱发期间，BLA 采用灌胃给药，JAK3 激动剂CA1 采用腹腔注射给药（给药剂量100 μg/kg），每天1次，共给药28 d。

3.2 行为学检测 分别在制模前和注射OXA 后第7、14、21和28天，采用von Frey 细丝实验和冷板实验对大鼠的疼痛敏感度进行分析。von Frey 细丝实验中采用已校准的细丝（2.0～26.0 g）对大鼠右后爪底中心皮肤进行垂直刺激，每次时间3 s，以右后爪快速退缩为阳性反应。若有响应则施加下一个较低质量的细丝；若无响应则施加下一个更高质量的细丝。记录能够引起阳性反应的最低质量（g），记为机械缩爪阈值。为了避免测试对大鼠的伤害，von Frey 细丝最高质量为26.0 g，且每次实验间隔5 min。冷板实验中，将大鼠置于放置有8 ℃冷板的透明塑料盒内，将大鼠左后爪接触冷板，记录其左后爪撤缩时间，即为冷刺激缩爪潜伏期。为避免伤害，切断时间为20 s，且每次实验间隔5 min。

3.3 电生理检测［9］大鼠麻醉断头后，取双侧L4～L6 DRG 部分组织剪碎，采用胶原酶Ⅰ（1 g/L）和中性蛋白酶Ⅱ（5 g/L）消化后，离心弃上清，采用完全培养基悬浮沉淀以获取单个神经元悬液。将上述神经元悬液加至细胞爬片（0.1 g/L赖氨酸包被）上培养2 h 后，采用膜片钳放大器采集诱发动作电位的最小电流、静息膜电位（resting membrane potential，RMP）和300 pA电流下动作电位数量，以此表示其兴奋性。

3.4 Western blot 检测蛋白水平 将L4～L6 DRG 组织置于-80 ℃保存。检测时，采用蛋白提取试剂盒提取后，采用BCA 试剂盒定量蛋白浓度。制备SDSPAGE，每组取30 μg蛋白变性后进行电泳分离，之后在半干转膜装置中转印到PVDF 膜。转膜成功后采用脱脂奶粉溶液封闭2 h，接着分别加入Ⅰ抗β-actin（1∶5 000）、Nav1.6（1∶500）、JAK2（1∶1 000）、STAT3（1∶2 000）、p-JAK2（1∶1 000）、STAT3（1∶2 000）抗体稀释液，4 ℃过夜后漂洗3 次，加入Ⅱ抗稀释液（1∶5 000）室温孵育1.5 h 后漂洗3 次，加入ECL 发光试剂显色。采用TANON 成像系统拍摄蛋白条带并进行灰度值分析。

3.5 RT-qPCR 检测 将DRG 组织置于TriPure 试剂中匀浆，加入氯仿/异丙醇抽提、乙醇洗涤后离心收集沉淀，干燥后加入RNase-free 水溶解获得RNA。采用逆转录试剂盒将其反转为cDNA，作为RT-qPCR反应体系的模板，采用FastStart™PCR Master 定量PCR 试剂盒进行扩增。采用2-ΔΔCt法以GAPDH 为内参照计算Nav1.6 mRNA 的相对水平。所需引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The primer sequences for RT-qPCR

4 统计学处理

采用GraphPad 8.0 和SPSS 22.0 对数据进行分析。计量数据以均数±标准差（mean±SD）表示，采用单因素方差分析进行多组间比较，进一步两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 草乌甲素减轻NP模型大鼠机械痛和冷痛敏感度

注射OXA 7、14、21 和28 d 后，与对照组比较，OXA 组机械痛和冷痛阈值明显减低（P＜0.05）。治疗14、21 和28 d 后，与OXA 组比较，0.12 mg/kg 和0.36 mg/kg 草乌甲素均可显著升高大鼠的机械痛和冷痛阈值（P＜0.05）。治疗21、28 d 后，0.04 mg/kg 草乌甲素可显著提高大鼠的冷痛阈值（P＜0.05），但对机械痛阈值无明显影响（P＞0.05）。0.12 mg/kg 和0.36 mg/kg 草乌甲素对机械痛和冷痛阈值的改善作用 明 显 优 于0.04 mg/kg 草 乌 甲 素（P＜0.05）。见图1。

Figure 1. Comparison of mechanical paw withdrawal threshold（A）and paw withdrawal lantency to cold stimulation（B）in each group. Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs OXA group；&P＜0.05 vs 0.04 mg/kg BLA+OXA group.图1 各组机械痛阈值及冷痛阈值的比较

2 草乌甲素抑制NP模型大鼠神经元的兴奋性

注射OXA 28 d 后，与对照组比较，OXA 组神经元的RMP 和动作电位数量明显增高，诱发动作电位的最小刺激电流明显减低（P＜0.05）；治疗28 d后，与OXA 组比较，0.12 mg/kg 和0.36 mg/kg 草乌甲素可显著减低RMP 和动作电位数量，并提高诱发动作电位的最小刺激电流（P＜0.05），0.04 mg/kg 草乌甲素则仅可显著提高诱发动作电位的最小刺激电流（P＜0.05）。与0.04 mg/kg 草乌甲素组比较，0.12 mg/kg和0.36 mg/kg 草乌甲素组神经元的兴奋性显著增加（P＜0.05）。见图2、表2。

表2 各组神经元兴奋性的比较Table 2. Comparison of excitability of neurons in each group（Mean±SD. n=8）

Figure 2. Comparison of the number of action potentials of neurons in each group.图2 各组神经元动作电位数量的比较

3 草乌甲素抑制NP 模型大鼠Nav1.6 的mRNA 和蛋白表达

注 射OXA 28 d 后，与 对 照 组 比 较，OXA 组Nav1.6 的mRNA 和蛋白表达明显增高（P＜0.05）。治疗28 d 后，与OXA 组比较，0.12 mg/kg、0.36 mg/kg草乌甲素可显著降低Nav1.6 的mRNA 和蛋白表达（P＜0.05），0.04 mg/kg 草乌甲素则对其表达无明显影响（P＞0.05）。0.12 mg/kg 和0.36 mg/kg 草乌甲素对Nav1.6 mRNA 和蛋白表达的抑制作用强于0.04 mg/kg草乌甲素（P＜0.05）。见图3A、图4。

4 草乌甲素抑制NP 模型大鼠JAK2/STAT3 通路活化

注射OXA 28 d 后，与对照组比较，OXA 组DRG组织中p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平明显增高（P＜0.05）；治疗28 d 后，与OXA 组比较，0.12 mg/kg 和0.36 mg/kg 草乌甲素可显著减低OXA 诱导的大鼠DRG 组 织 中p-JAK2 和p-STAT3 的 蛋 白 水 平（P＜0.05），0.04 mg/kg 草乌甲素则对JAK2 和STAT3 磷酸化无明显调节作用（P＞0.05）。0.12 和0.36 mg/kg草乌甲素对JAK2 和STAT3 磷酸化的抑制作用强于0.04 mg/kg草乌甲素（P＜0.05）。见图3B、图4。

Figure 3. The images of Western blot for determining the protein levels of Nav1.6（A），and JAK2，STAT3，p-JAK2 and p-STAT3（B）in the rats of each group.图3 Western blot检测各组大鼠Nav1.6、JAK2、STAT3、p-JAK2和p-STAT3蛋白水平的变化

Figure 4. Comparison of Nav1.6 expression at mRNA and protein levels，and protein levels of p-JAK2 and p-STAT3 in each group.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs OXA group；&P＜0.05 vs 0.04 mg/kg BLA+OXA group.图4 各组Nav1.6的mRNA和蛋白表达及p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3蛋白水平的比较

5 草乌甲素调控JAK2/STAT3通路抑制Nav1.6的表达和神经元兴奋性

与OXA 组比较，0.36 mg/kg 草乌甲素可显著降低OXA 大鼠DRG 组织中p-JAK2、p-STAT3 和Nav1.6的蛋白水平及动作电位数量（P＜0.05）；与0.36 mg/kg 草乌甲素组比较，JAK2 激活剂C-A1 可显著减弱草乌甲素对OXA 诱导的大鼠DRG 组织p-JAK2、p-STAT3和Nav1.6的蛋白水平及动作电位数量的作用（P＜0.05）。见图5、6。

Figure 5. Effect of bulleyaconitine A（BLA）on Nav1.6 protein expression（A）and number of action potentials（B）of neurons by regulating JAK2/STAT3 signaling pathway.图5 草乌甲素调控JAK2/STAT3通路对Nav1.6蛋白表达和对神经元动作电位数量的影响

讨 论

临床中目前通常以抗抑郁、抗惊厥等药物治疗化疗性NP，但效果并不能达到预期目标，且会产生一定副作用［12］，因此寻找安全有效的治疗药物仍有必要。草乌甲素为提取自天然产物的镇痛剂，广泛应用于临床中多种疼痛的治疗。本研究发现，给予草乌甲素治疗后，OXA 诱导NP大鼠的机械痛和冷痛阈值明显增高，可见草乌甲素可降低OXA 大鼠的疼痛敏感度，表明草乌甲素对化疗性NP 也有一定治疗作用。OXA 和其他化疗药物一样，主要积累在DRG中并损伤周围神经，引起大鼠DRG 中神经元过度兴奋和Nav1.6表达上调，降低Nav1.6表达可降低神经元兴奋性并减轻NP 症状［10］。本研究在OXA 诱导的大鼠DRG 中观察到了同样的变化，且0.12 mg/kg、0.36 mg/kg 草乌甲素均可明显抑制Nav1.6 表达，降低神经元静息膜电位和动作电位数量，并提高诱发动作电位的最小电流。由于电压门控钠离子通道在神经中广泛分布，其改变可直接调节神经元的兴奋性，引起非正常异位放电，而非正常异位放电又是NP 发生的病理生理基础之一［13］。其中，Nav1.6 广泛分布于神经系统包括中枢神经系统和DRG 神经元中，位于伤害性感觉神经元的胞体和轴突起始端。Nav1.6 在DRG 中高表达，可使钠离子通道失活率降低及复位速度加快，增加神经元兴奋性，参与异位放电的形成，引起疼痛，敲除DRG 中Nav1.6可减弱神经损伤处神经元的兴奋性，减轻神经损伤诱导的机械性异常疼痛［14］。另外，Nav1.6 参与2 型糖尿病患者病理性神经痛的发生过程，而Nav1.6在DRG 中的上调也参与骨癌痛的发生过程［15］。因此推测草乌甲素减轻OXA 诱导的大鼠NP 症状可能与其调控Nav1.6表达和神经元兴奋性有关。

Figure 6. Comparison of protein levels of p-JAK2，p-STAT3 and Nav1.6，and neuronal action potential number（APN）in each group. Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs OXA group；#P＜0.05 vs BLA group.图6 各组p-JAK2、p-STAT3和Nav1.6蛋白水平及神经元动作电位数量的比较

已有研究表明，神经中Nav1.6 等表达异常可导致神经元兴奋性增加，并引起NP 等症状［16］，但其分子机制尚不明确。JAK2/STAT3 通路在多种NP 疾病中起重要作用，在神经损伤引起的NP 大鼠中发现，JAK2/STAT3 信号通路通过上调损伤神经中炎症因子的表达来介导NP 的维持［17］。紫杉醇可增加JAK2和STAT3 的磷酸化，诱导JAK2/STAT3 通路活化，损伤神经系统，产生疼痛［18］。本研究中，草乌甲素可显著降低OXA 诱导的大鼠DRG 神经元中上调的p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平，揭示了草乌甲素对JAK2/STAT3 通路的抑制作用。然而，STAT3 途径的激活可引起Nav1.6 的表达上调，导致L5-VRT 诱导的神经性疼痛［19-20］。为进一步明确JAK2/STAT3信号通路在草乌甲素改善OXA 诱导大鼠NP 症状中的作用，本研究采用JAK 激动剂进行研究。与草乌甲素单一干预组比较，JAK2 激动剂可显著减弱草乌甲素对OXA 诱 导 的 大 鼠DRG 组 织p-JAK2、p-STAT3 和Nav1.6 蛋白水平的调控作用，进一步验证了草乌甲素对OXA 诱导的大鼠JAK2/STAT3 通路的调节作用，同时提示草乌甲素对OXA 诱导的大鼠DRG 组织Nav1.6 表达的调控作用可能与其调节JAK2/STAT3通路有关。也有研究指出，蛋白酶激活受体2（proteinase-activated receptor 2，PAR2）和磷酸肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）通路也可能为药物治疗OXA 诱导NP 的作用靶点［21-22］。而本研究也显示，JAK2 激动剂并不能完全逆转草乌甲素对JAK2/STAT3通路和Nav1.6蛋白的调节作用，提示草乌甲素调节Nav1.6 蛋白、减轻OXA 诱导的大鼠NP症状的分子机制可能涉及其它通路，值得继续探究。

综上所述，本研究认为草乌甲素可调节JAK2/STAT3 通路，继而通过抑制Nav1.6 蛋白表达而降低神经元兴奋性，从而减轻OXA诱导大鼠的NP症状。