线粒体分裂抑制剂1对NK细胞活化的影响*

陈旭青， 周龙云， 史 军， 吴继勇， 严芮雯， 严道南， 马华安△

（1南京中医药大学附属医院耳鼻喉科，江苏南京 210029；2南京医科大学第一附属医院康复医学中心，江苏南京 210029）

自然杀伤（natural killer，NK）细胞是人体非特异免疫系统的组成部分，具有分泌系列细胞因子的潜能［1-2］，其所处微环境不同，细胞因子分泌不一，而发生NK1 或NK2 型活化［3］。研究表明，NK 细胞NK2 型活化释放Th2型因子，协调T、B 细胞等介导Th2型反应，与多种变应性疾病发生发展密切相关［4-5］，但其异常活化内在机制及调节因素尚不明确。

线粒体是高度动态的网管状细胞器，通过频繁地分裂、融合以维持内部稳态，其分裂/融合动态失衡、结构紊乱与多种细胞功能紊乱密切关联［6］。近年研究显示，线粒体动态失衡、分裂亢进与NK 细胞异常活化密切相关［7-8］。线粒体分裂抑制剂1（mitochondrial division inhibitor-1，Mdivi-1）为特异性调控线粒体动态变化的通用分子，对线粒体过度分裂触发的T 细胞、巨噬细胞等免疫细胞功能紊乱具有重要作用［9-10］。基于此，本研究拟选取Mdivi-1 这一选择性线粒体分裂抑制剂，探讨调控线粒体动态变化对NK细胞活化的影响。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 主要仪器 Herocell 180 型CO2培养箱（Thermo）；ELx 800 型酶标仪（BioTek）；ChemiDoc XRS 型化学发光凝胶成像仪和CFX96 Touch 型实时定量PCR 仪（Bio-Rad）；Accuri C6 型流式细胞仪（BD）；DMI 3000B 型倒置荧光显微镜和SP8 型激光共聚焦显微镜（Leica）。

1.2 主要药品与试剂 Mdivi-1（货号M0199）购自Sigma-Aldrich；重组人胸腺基质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP；货号300-62）购自PeproTech；α-MEM 培养基、马血清（horse serum，HS）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和巯基乙醇（货号11900024、16050122、10100147 和614272）购自Gibico；肌醇、叶酸和PBS 粉末（货号A600536、A610466 和B040100）购自生工生物工程股份有限公司；Trizol（货号15596018）购自Thermo；反转录试剂盒（货号RR036A）购自TaKaRa；实时荧光定量PCR试剂盒（货号11203ES03）购自上海翊圣生物科技有限公司；线粒体超氧化物荧光探针（MitoSOX Red）试剂盒（货号40778ES50）购自上海翊圣生物科技有限公司；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、30%丙烯酰胺溶液、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和BCA 蛋白定量试剂盒（货号ST795、ST626、ST00、ST025 和P0012）购自上海碧云天生物技术有限公司；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（货号IPVH00010）购自Millipore；兔抗人干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）单克隆抗体、兔抗人p-JAK2 单克隆抗体、抗人JAK2 单克隆抗体、兔抗人p-STAT6 多克隆抗体、兔抗人STAT6 单克隆抗体和兔抗人β-肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体（货号ab133566、ab32101、ab108596、ab28829、ab32520 和ab8227）均购自Abcam；小鼠抗白介素4（interleukin-4，IL-4）单克隆抗体和抗人IL-5 多克隆抗体（货号66142-1-Ig和26677-1-AP）购自Proteintech；细胞计数试剂盒、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔IgG 和HRP 标记的山羊抗小鼠IgG（货号C0038、A0208 和A0216）购自上海碧云天生物技术有限公司；其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为纯化水或超纯水。

1.3 实验细胞 人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的NK细胞系NK-92MI（货号GOY-ATCC-0016）购自上海谷研实业有限公司。以含12.5%FBS、12.5%HS、0.2 mmol/L 肌醇、0.1 mmol/L 巯基乙醇和0.02 mmol/L 叶酸的α-MEM 培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

2 方法

2.1 细胞活力的测定 回收生长良好的NK-92MI细胞，按每孔90 μL完全培养基，以每孔1×104细胞密度接种细胞于96 孔板中，分为对照组和Mdivi-1 组（终浓度为0.1、0.5、1、5、10、25、50 和100 μmol/L），并设置调零孔。Mdivi-1 组加入10 μL 含不同浓度Mdivi-1 的培养基，对照组加入含0.1% DMSO 的完全培养基。于培养箱中继续培养24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 试剂孵育1 h。450 nm 波长下，酶标仪检测每孔吸光度（A）值。

2.2 实验分组 NK-92MI 细胞分为空白组、TSLP组、1 μmol/L Mdivi-1 组、5 μmol/L Mdivi-1 组和10 μmol/L Mdivi-1 组。TSLP 组细胞以20 μg/L TSLP 刺激24 h，诱导NK 细胞的NK2 分化。Mdivi-1 组于20 μg/L TSLP 刺激下，同时联合相应浓度Mdivi-1 干预24 h。

2.3 RT-qPCR 回收干预后NK-92MI 细胞，以Trizol试剂分离各组样本总RNA，并逆转录为cDNA。以cDNA 为模板，进行实时定量PCR 扩增。反应体系：SYBR 荧光染料10 μL，正、反义引物各0.4 μL，cDNA 模板2 μL，无核酸酶水7.2 μL。正、反义引物序列见表1。反应条件为：95°C 预变性3 min；95 ℃变性10 s，57 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，39 个循环。以β-actin 为内参照，采用2-ΔΔCt法分析各样本IL-4、IL-5和IFN-γ的mRNA表达水平。

表1 引物序列RT-gPCRTable 1. Primer sequences for RT-gPCR

2.4 Western blot 分析 回收细胞样本，经裂解、匀浆、静置、离心后，获取蛋白上清。BCA 法测定蛋白浓度，调整终浓度，高温变性后-80 ℃冻存备用。取蛋白样品经SDS-PAGE并转移至PVDF膜上，5%BSA的TBST 室温封闭后，分别加入以1%BSA 稀释的抗IL-4、IL-5、IFN-γ、p-JAK2、JAK2、p-STAT6、STAT6 和β-actin 抗体（稀释比例均为1∶2 000），4 ℃孵育过夜。次日孵育HRP 标记山羊抗兔或小鼠IgG。滴加ECL曝光液，以Bio-Rad 化学发光检测仪显影，拍照保存。图像以ImageJ 1.8.0软件分析。

2.5 细胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）的检测 离心收集处理后细胞，以含2 μmol/L MitoSOX Red 的α-MEM 培养基重悬，CO2培养箱中孵育30 min。离心，PBS洗涤，弃上清。500 μL PBS重悬，Accuri C6流式细胞仪检测荧光强度。

3 统计学处理

所有实验数据采用GraphPad Prism 7.0.1 软件行统计学分析。数据均以均数±标准差（mean±SD）表示。组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 Mdivi-1对NK-92MI细胞活力的影响

CCK-8 实验结果显示，50 μmol/L 及以内Mdivi-1干预NK-92MI 细胞，其细胞活力无显著下降。鉴于25 μmol/L Mdivi-1 干预后，细胞活力有一定下降倾向，我们纳入1、5和10 μmol/L 浓度Mdivi-1进行后续干预。见图1。

Figure 1. Effects of Mdivi-1 at different concentrations on the viability of NK-92MI cells. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs 0 μmol/L group.图1 不同浓度Mdivi-1对NK-92MI细胞活力的影响

2 Mdivi-1 对NK-92MI 细 胞IL-4、IL5 和IFN-γ mRNA和蛋白表达的影响

与对照组比较，TSLP组NK-92MI细胞IL-4和IL-5 的mRNA 表达显著升高，IFN-γ 的mRNA 表达下降（P＜0.05）；与TSLP 组比较，5 和10 μmol/L Mdivi-1 组IL-4 和IL-5 的mRNA 表达降低，IFN-γ 的mRNA 表达则有所回升（P＜0.05）。Western blot 分析结果显示，TSLP 刺激后，NK-92MI 细胞IL-4 和IL-5 的蛋白表达升高，而IFN-γ 的蛋白表达有所下调；Mdivi-1 干预后，一定程度上逆转了TSLP刺激所诱导的IL-4和IL-5 蛋白水平升高及IFN-γ 水平降低，且该效应与药物剂量呈正相关。见图2A、表2。

4 Mdivi-1 对NK-92MI 细 胞JAK2 和STAT6 活 化的影响

与对照组比较，TSLP 组NK-92MI 细胞JAK2 和STAT6 蛋白磷酸化水平显著升高（P＜0.05）；与TSLP组对比，5 和10 μmol/L Mdivi-1 组JAK2 磷酸化水平显著降低，10 μmol/L Mdivi-1组STAT6磷酸化水平显著降低（P＜0.05），见图2B、表2。

表2 各组NK-92MI细胞IL-4、IL-5和IFN-γ mRNA和蛋白表达水平及p-JAK2和p-STAT6蛋白水平的比较Table 2. The expression of IL-4，IL-5 and IFN-γ at mRNA and protein levels，and the protein levels of p-JAK2 and p-STAT6 in each group（Mean±SD. n=3）

5 Mdivi-1对NK-92MI细胞内ROS生成的影响

Figure3. The images of flow cytometry and quantitative analysis of MitoSox Red fluorescence in NK-92MI cells of each group. Mean±SD. n=4.**P＜0.05 vs control group；##P＜0.01 vs TSLP group.图3 各组NK-92MI细胞MitoSOX Red流式细胞术分析

MitoSOX Red 探针染色显示，与对照组比较，TSLP 组NK-92MI 细胞的ROS 水平显著升 高（P＜0.05）；而5 和10 μmol/L Mdivi-1 干预则有效抑制了TSLP 刺 激 下 生 成ROS 水 平 的 升 高（P＜0.01），见图3。

讨 论

NK 细胞为固有免疫重要成员，其异常活化参与多种变应性疾病的发生发展［5，11-12］。近年研究示，NK细胞异常活化随着线粒体功能紊乱或过度分裂变化［8，13］，但两者关联尚不明确。Mdivi-1 为选择性逆转线粒体分裂事件的经典化学分子［14］，已被广泛运用于线粒体动态变化与肿瘤、神经退行性、心血管和自身免疫性疾病等关联的探索之中［14-15］。我们前期研究示，Mdivi-1可有效抑制脂多糖、谷氨酸等诱导的小胶质细胞和神经元等线粒体分裂，以逆转过度免疫应答及凋亡事件［16-17］。鉴于Mdivi-1 调控线粒体分裂变化，揭示线粒体动态与诸功能细胞病理变化相因关联的通用性，本研究选取Mdivi-1 干预异常活化NK 细胞，拟揭示NK 细胞异常活化的潜在机理，并为NK 细胞异常活化的调节寻找可能干预方案具有重要价值。

NK 细胞于不同环境刺激下，可向多个细胞亚型分化。其中NK1 型活化，分泌INF-γ 等标志性因子，促进Th1 型反应；NK2 型分化，则高表达IL-4 和IL-5等经典Th2 型细胞因子，介导变应性炎症反应［18］。TSLP 则为诱导变应性炎症、T 细胞Th2 型分化及NK细胞NK2 型活化的重要化学试剂，且对多种免疫细胞线粒体功能蛋白表达及形态变化具有重要影响［19-20］。我们研究显示，与对照组比较，TSLP 组NK-92MI细胞的IL-4和IL-5蛋白表达显著提高，IFN-γ的水平相应下调，其符合NK2 型活化表征。与TLSP 组对比，5 和10 μmol/L Mdivi-1 组IL-4 的表达水平降低，IFN-γ 的表达水平有所回升，10 μmol/L Mdivi-1组IL-5 的表达下调。RT-qPCR 结果进一步验证了Mdivi-1 对TSLP 刺激下NK 细胞IL-4 和IFN-γ 表达偏移的调节作用，提示Mdivi-1 能有效抑制TSLP 刺激所诱导的NK细胞NK2型分化。

JAK2 和STAT6 为调控细胞增殖、分化、胶原合成及免疫应答等生命活动的重要信号分子，其活化参与变应性炎症的进展，与变应性鼻炎、哮喘和特异性皮炎等疾病发生发展密切相关［21-22］。大量研究表明，T 细胞、B 细胞、肥大细胞和NK 细胞等异常分化，释放促Th2 型反应因子，常伴随着内部JAK2 和STAT6 信号分子磷酸化水平升高［23-25］，而抑制JAK2和STAT6 信号分子活化则能有效逆转其异常活化，改善变应性炎症反应进程［25-27］。我们的Western blot结果显示，在20 μg/L TSLP 刺激下，NK-92MI 细胞的p-JAK2 和p-STAT6 蛋白水平显著升高，符合其NK2型活化内在表现［28］。而Mdivi-1干预后，TSLP诱导的NK-92MI细胞p-JAK2 和p-STAT6 蛋白水平的升高得到一定程度下调，且该效应随着药物剂量上调呈增强趋势。线粒体过度分裂等所致的ROS大量生成是JAK2 和STAT6 等分子活化的重要上游信号，其与变应性反应相关免疫细胞功能紊乱关联密切［29-30］。MitoSOX Red 染色显示，在TSLP 刺激下，NK-92MI 细胞ROS 水平明显升高，5 和10 μmol/L Mdivi-1 干预则能有效逆转这一现象。上述结果表明，Mdivi-1 抑制TSLP 诱导的NK 细胞NK2型活化可能与其对ROS 及JAK2/STAT6信号通路的调节作用相关。

由于原代NK 细胞培养难度较大，本研究以NK92MI细胞株作为实验对象，其实验结果可能存在一定偏倚。本研究中，Mdivi-1 为选择性发动蛋白相关蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）抑制剂，其通过抑制Drp1 活性实现抑制线粒体分裂，若能选择Drp1基因沉默技术进一步验证实验结果则可提高结论的可靠性。另鉴于Mdivi-1 为线粒体形态调控的经典试剂，本研究未对NK 细胞线粒体形态变化进行复核，或对结果可靠性产生一定影响。于后续进一步机制研究中，我们拟采用电镜及共聚焦技术对该指标全面检测。

综上所述，Mdivi-1能有效抑制TSLP刺激所诱导的NK 细胞NK2 型分化，该效应可能与其对ROS 及JAK2/STAT6 信号分子的调节作用相关。线粒体异常分裂可能是NK细胞异常分化的重要机制。