FQ-PCR方法检测腹泻仔猪肠道内乳酸杆菌和双歧杆菌试验

赵 娟，王志宇，段昌学，王志俊，刘一飞，赵 敏，韩洁茹，李正莉

(1.山西农业大学动物医学学院，山西 太原 030032；2.陕西省商洛市动物疫病预防控制中心，陕西 商洛 726000)

肠道菌群种类繁多，菌群计量及检测有较大困难，国内外学者已建立了许多诊断方法，如细菌分离鉴定、凝集试验、琼脂扩散试验、荧光抗体技术、ELISA(酶联免疫吸附试验)试剂盒等，但这些方法均费时费力，而且灵敏性均不理想，不适用于常规的临床诊断，更不适用于集约化生产中细菌检测的需要。随着分子生物学检测技术的快速发展，以及聚合酶链反应技术的广泛应用，特别是16S rRNA被广泛应用于细菌的鉴定，分子生物学检测方法PCR用于Lactobacillus和Bifidobakterien定量的检测具有快速、灵敏、特异等优点，但假阳性较多，缺乏准确定量等缺点限制了PCR在实际临床中的应用[1]。近年来，FQPCR技术以其特异性强、灵敏度高、稳定性强等优点在微生物的定性和定量检测等方面得到广泛应用。本研究建立了快速检测Lactobacillus和Bifidobakterien的FQ-PCR方法，不仅保留了PCR的优点，而且克服了普通PCR的不足，为动物肠道微生态的测定建立了一种更为有效的方法[2]。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

微量移液器(Eppenderf公司，10 µL、100 µL、200 µL、1 000 µL型)，PCR仪(QIAGEN，Rotor-Gene Q型)，高速低温离心机(Sigma，2-16PK型)，电子天平(METTLER TOLEDO，AL104-IC型)，高速离心机(Eppendorf，1-14型)，摩尔基因型超纯水机(上海摩勒生物科技有限公司，MO6-063型)，立式压力蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂，YXQ-LS-SⅡ型)，电热恒温鼓风干燥箱(上海联进医疗器械厂，101-2-BS-Ⅱ型)，超低温冰箱(中科美菱公司)。

1.2 主要试剂和材料

QIAamp DNA Stool Mini Kit购自Qiagen公司；TransStart®Probe qPCR SuperMix购自Qiagen公司；酒精为国产试剂。

1.5 mL进口薄壁离心管购自Corning公司；0.2 mL进口薄壁离心管购自Corning公司；0.2 mL平盖八排管购自Axygen公司；5 mL有盖离心管为国产；1 mL、200 µL、10 µL吸头均为国产；一次性使用棉签、手套、口罩为国产。试验材料(腹泻仔猪和健康仔猪的粪便样本)来源于山西省农业科学院畜牧兽医研究所猪场及山西省天禄丰种猪场。

2 试验步骤

2.1 设计qPCR引物[3]

引物序列见表1。

表1 引物序列

2.2 采集粪便样品

2020年9月23日至10月23日，在天气温度骤降仔猪腹泻高发期或仔猪腹泻发病集中期，项目组在太原市小店区南郊繁峙镇的宏利猪场、山西省运城市夏县众旺养殖专业合作社、夏县宏伟农牧有限公司、夏县健源养殖专业合作社、夏县嘉博养殖有限公司等多地采取典型病例粪便作为试验样本。用棉签将健康仔猪和腹泻仔猪粪便采集入已消毒的5 mL离心管内，封盖。每份样品贴标签，详细注明日期、组织来源、编号。注意样品一定为新鲜粪便。采集到的样本带回实验室-80 ℃保存。分3批次采集样本，每批次采集健康仔猪粪便和腹泻仔猪粪便各20份。

2.3 粪便中总DNA提取

1)称取180～220 mg粪便加入预冷的2 mL离心管中；2)每管加入1.4 mL的缓冲液ALS(试剂)，涡旋使其完全混匀；3)370 ℃孵育5 min，使其完全裂解；4)涡旋混匀15 s，14 000 r/min离心1 min；5)取1.2 mL的上清液至新的2 mL离心管中，弃沉淀；6)每管加入一片InhibitEX Tablet，立即涡旋直至完全混匀，室温孵育1 min；7)14 000 r/min离心3 min；8)取全部上清液至新的1.5 mL离心管中，弃沉淀，14 000 r/min离心3 min；9)取新的1.5 mL离心管，每管提前加入15 μL蛋白酶K；10)从第8步中移200 μL上清液至新的1.5 mL离心(已加蛋白酶K)管中；11)加入200 μL的缓冲液，涡旋混匀15 s；12)70 ℃孵育10 min；13)加入200 μL的无水乙醇，完全混匀；14)将全部的上清加入QIAamp spin column柱中，14 000 r/min离心1 min，弃收集管废液，将柱子重新放入新的收集管中；15)加入500 μL的AW1缓冲液，14 000 r/min离心1 min，将柱子移至新的2 mL收集管中；16)加入500 μL的AW2缓冲液，14 000 r/min离心3 min，弃收集管废液，将柱子重新放入新的收集管中；17)将柱子放入新的1.5 mL离心管中，14 000 r/min离心1 min；18)将柱子放入新的1.5 mL离心管中，加入200 μL的缓冲液AE，14 000 r/min离心1 min；19)将提取好的DNA做标记，-80 ℃长期保存。

2.4 荧光定量PCR

2.4.1 将DNA从-20 ℃冰箱拿出后置于冰上解冻。

2.4.2 按照以下反应体系配置反应体系于平盖八排管中(表2)。

表2 荧光定量PCR反应体系

2.4.3 将八排管的管盖轻轻盖到八排管上；将八排管放入荧光定量PCR仪中进行反应并设置参数，PCR反应程序如下(表3)。

表3 荧光定量PCR反应程序

2.4.4 待PCR结束后，按照Ct值计算检测基因的表达情况[4]。

3 试验结果

(1)粪便中所提取全DNA浓度及纯度见表4。

表4 第1～3批次样本中提取的全DNA浓度及纯度

(2)CT值大，说明拷贝数小，样本本身mRNA的数量少。从图1、图2中可以看出，健康组和腹泻组相比，腹泻组的CT值大，说明其样本本身所含的mRNA的量少，即：相对比健康仔猪来说，腹泻仔猪中乳酸杆菌和双歧杆菌的mRNA的量都少。说明因为腹泻，仔猪肠道中乳酸杆菌和双歧杆菌的数量减少，腹泻影响了仔猪肠道环境微生态的平衡和健康[5]。

图1 样本中双歧杆菌扩增CT值示意图

图2 样本中乳酸杆菌扩增CT值示意图

(3)断奶仔猪腹泻的原发性因素主要是由于断奶应激引起机体神经内分泌紊乱，肠道微生物区系平衡遭到破坏，造成治病菌大肠杆菌的增殖，益生菌减少，从而导致更为严重的腹泻，所以补充益生菌能够有效防治仔猪腹泻的发生，为兽医临床防治断奶仔猪腹泻提供理论依据[6]。