实验室常用猪精液的低温保存方法

曹丹　马永和　张永平

随着养猪生产的发展和产业化进程的推进。人们对猪人工授精重要性的认识越来越深刻，在现代养猪生产和育种工作中，人工授精正成为一种非常重要的生产途径。在猪的生产方面，人工授精技术的应用低温保存与冷冻精液相比，具有更好的受胎率和产仔数，而且操作简单，取材方面，更利用推广应用。现将总结的猪精液的低温保存方法介绍如下：

1 精液的采集

用38°C左右的热水预热集精杯，并将杯内套入食品级塑料袋，并将消毒好的四层滤纸罩在杯口上，用橡皮筋套住。采用手握法采集精液，边采集边滤掉胶状物，精液采集后要立即丢掉滤纸，盖好杯盖，送往实验室检查。

2 精液品质的检查

采集精液后，迅速置于30°C左右的恒温水浴中，然后取样进行品质检查，精子活力在70%以上，且无异味，乳白色，方可用于保存或输精。

3 精液的稀释和保存

3.1 低温保存稀释液的配制

准确称取如下药品：葡萄糖2.5克、蔗糖3.3克、青霉素0.06克、链霉素0.1克、0.05%EDTANa2（乙二胺四乙酸二钠），置入烧杯中。量取去离子水80毫升将其溶解后，搅拌至少30分钟，分装于离心管内（规格50毫升）。离心机以7276倍重力，离心30分钟后，取其上清液分装于5毫升的离心管内，置于4°C保存備用。

3.2 精液的第一次降温、离心和稀释

把盛有符合要求的精液（存活率70%以上）塑料瓶用4层毛巾包裹好后，置于17°C的冰箱中进行1小时的降温。精液经降温处理后，分装于50毫升的离心管中，以250倍重力离心8分钟。收集上清液置于灭菌的塑料瓶内，再次置入冰箱内（17°C）内静置30分钟。用离心管（规格5毫升）分装，每个离心管内装入精液1毫升，用低温保存稀释液1∶2进行同温稀释。

3.3 精液的二次降温和4°C低温保存

用四层毛巾将精液离心管进行保温处理后，放入冰箱内（4°C）进行缓慢降温。观察离心管中的精液温度降到4°C时，将上述处理的离心管置入到4°C的恒温水中保存。

4 低温保存精液的使用

从冰箱中取出保存的精液，移液器移取50微升注入1.5毫升的离心管内，添加同温的低温保存稀释液1毫升，缓慢混合均匀后，置入35～37°C水浴锅中孵育15分钟。取10微升稀释后的精液在血细胞计数板上压片，并于37°C载物台上观察精子活力等相关指标。

5 低温保存方式的机理探讨

在0～5°C条件下，精子的活力被抑制，降低代谢水平，减少能耗，精子的存活时间得以延长。在低温保存下，10～0°C温度范围对精子是一个危险的温度范围区，如果精液从常温状态迅速降至0°C，精子就会发生不可逆的冷休克现象。所以精液在低温保存之前，需经预冷平衡。其具体做法为：每分钟降温0.2°C，用1～2小时完成降温全过程。