食管癌患者血清神经元特异性烯醇化酶与长链非编码RNA ITGA9-AS1水平联合检测的实验诊断价值研究

朱 娇，孙国才，刘素荣，王英英

(1.兵器工业五二一医院a.肿瘤血液病科;b.老年病科，西安 710065;2.陕西中医药大学附属医院肿瘤二科，陕西咸阳 712000)

食管癌(esophagus cancer,EC)是我国常见恶性肿瘤之一，其发病较隐匿，患者就诊时大多已处于中晚期，致死率高[1-2]。临床上对EC 患者主要采用手术治疗并辅以放疗、化疗和生物治疗，大量研究显示中晚期EC 患者的生存率较早期明显降低，因此早期的EC 诊疗是提高患者预后的关键点[3]。近年来有报道指出神经元特异性烯醇化酶(neuronspecific enolase,NSE)对EC 的诊断具有一定价值和意义[4]，但敏感度不高。目前已有多种与EC 密切相关的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)被鉴定出来，其广泛分布于血清、脑脊液和血浆等体液中[5]。lncRNA ITGA9-AS1 在乳腺癌中低表达且与患者病理特征恶化有关[6]，关于lncRNA ITGA9-AS1 在EC 中的表达及意义尚不明确。本研究通过测定NSE 和血清lncRNA ITGA9-AS1 水平，旨在分析其在EC 中的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2018年5月～～2019年7月兵器工业五二一医院收治的112 例EC 可疑病变患者为研究对象，其中男性59 例，女性53 例；年龄30～71 岁，平均年龄51.04±8.97 岁。经病理学检查确诊67 例EC 患者为EC 组，45 例食管良性病变为食管良性病变组(食管炎12 例、食管溃疡27 例和Barrett 食管6 例)。本研究经由我院伦理委员会审批。

纳入标准：①研究对象均经胃镜检查有黏膜粗糙和食管糜烂等表现，出现吞咽不适、反酸等不适者；②临床资料完整；③自愿参与本研究且签署知情同意书。

排除标准：①合并重要脏器功能衰竭者；②并发其他恶性肿瘤和严重感染者。

1.2 仪器与试剂 雅培I2000 型电化学发光免疫分析仪，Trizol 试剂购自Invitrogen 公司，SYBR Green Realtime PCR Master Mix 扩增试剂盒购自日本ToYoBo 公司，TakaRa Prime-Script RT reagent kit购自大连宝生物工程有限公司，血清RNA 提取试剂盒购自北京天根公司，荧光定量PCR 仪(美国Bio-rad 公司)，lncRNA ITGA9-AS1 及内参引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 方法 采集两组晨起空腹肘静脉血3 ml，12 000 r/min离心10 min 分离血清，-20℃保存。采用电化学发光免疫分析仪和配套试剂盒检测NSE 水平。

取EC 组织和食管良性病变组织，采用血清RNA 提取试剂盒提取组织中的总RNA，采用Taka-Ra Prime-Script RT reagent kit 将血清总RNA 逆转录为cDNA，采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测血清lncRNA ITGA9-AS1和内参基因GAPDH 的水平。lncRNA ITGA9-AS1引物序列为：F:5’-GTTCTGAAAATCACAGTCATC CCTA-3’，R:5’-TGTGCTTCCGTCACCTCTAAATC-3’。GAPDH 引物序列为：F:5’-ATTCCATGGCACCGT CAAGGCTGA-3’，R:5’-TTCTCCATGGTGGTG AAGACGCCA-3’。95℃预变性2 min，95℃ 15s，60℃30s 共40 个循环，用2-ΔΔCt值计算lncRNA ITGA9-AS1 的相对表达量。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0 统计学软件处理数据，满足正态性分布及方差齐性的计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用t检验，相关性分析采用Pearson 相关分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 水平的比较 EC 组患者血清NSE（22.71±3.03μg/L vs 2.98±0.22μg/L）和lncRNA ITGA9-AS1（0.88±0.21 vs 0.64±0.14）的表达水平高于食管良性病变组，其差异具有统计学意义（t=13.33，6.41，均P=0.00）。

2.2 EC 患者NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 水平与病理分期、肿瘤浸润深度的关系 见表1。III 期EC 患者血清NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 水平显著高于I期和II 期，其差异具有统计学意义(P＜0.01)，另外肿瘤浸润深度T4 血清NSE 和lncRNA ITGA9-AS1水平显著高于T1，其差异具有统计学意义(P＜0.01)。

表1 EC 患者NSE 和lncRNA ITGA9-AS1水平与病理分期、肿瘤浸润深度的关系

2.3 血清NSE，lncRNA ITGA9-AS1 水平与EC 患者病理分期、肿瘤浸润深度的相关性 Pearson 相关性分析结果显示，血清NSE，lncRNA ITGA9-AS1 水平与EC 患者病理分期、肿瘤浸润深度呈显著正相关(r=0.142，P=0.005；r=0.171，P=0.013)。

2.4 血清NSE，lncRNA ITGA9-AS1 联合检测对EC 的诊断价值 血清NSE，lncRNA ITGA9-AS1 诊断敏感度均较低（23.9%，53.0%），但均具有较高的特异度（93.7%，90.2%）。联合检测在EC 中有较高的敏感度和特异度，分别为82.1%和83.2%。

3 讨论

EC 位居世界癌症死因的第6 位，我国EC 患者的死亡和发病病例约占全球的50%，尤其是医疗卫生相对欠发达的中西部农村高发地区，EC 给当地患者带来了巨大的经济负担和精神压力[7]。EC 发病隐匿导致就诊时患者大多无法治愈，预后较差。流行病学指出发展中国家EC 患者的5年生存率小于5%，NSE 是神经内分泌细胞特有烯醇化酶的同工酶，在小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)中过量表达[8]，其还可用于小儿神经母细胞瘤病情和治疗效果的评估[9]。屈雪等[10]指出NSE在EC 患者中的表达高于食管良性病变组，但是单独检测其特异度较低。目前已有多种与EC 密切相关的lncRNA 被鉴定出来，其广泛分布于血清、脑脊液和血浆等体液中[11-12]。lncRNA ITGA9-AS1 在乳腺癌中低表达且与患者病理特征恶化有关，关于lncRNA ITGA9-AS1 在EC 中的表达及意义尚不明确。本研究通过测定血清NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 水平，旨在分析其在EC 中的诊断价值。

本研究结果显示：相较于食管良性病变组，EC组患者血清NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 过量表达，并且随着EC的进展，分期愈晚，肿瘤浸润深度愈深，血清NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 水平愈高，说明NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 可用于EC 的早期诊断。但敏感度、特异度分析提示，单一标志物检测敏感度欠佳，无法用于EC 的诊断和病情评估，应用价值有限。当联合NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 时敏感度和特异度均较高，分别为82.1%和83.2%，说明联合检测可有效弥补单项指标检测敏感度不强的缺点。

综上所述，血清NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 联合检测可提高EC早期诊断的敏感度，值得深入研究。