冠心病并发高血压患者外周血白细胞SREBP-1 mRNA表达水平与脂质代谢紊乱的关系研究

张训男，彭春艳，李显东，张吉才

（1.锦州医科大学十堰市太和医院研究生培养基地，湖北医药学院附属医院，湖北十堰 442000；2.十堰市太和医院检验科，湖北十堰 442000）

冠心病（coronary artery disease，CAD）是影响世界人口的主要心血管疾病之一，也是导致发达国家和发展中国家死亡的主要原因[1]。高血压是CAD 的重要致病因子[2]，血压升高可以引起微血管病变，导致冠状动脉储备能力下降，引起冠状动脉病变[3]；也可导致内皮细胞损伤，引发动脉粥样硬化。脂代谢紊乱，其症状表现为血浆三酰甘油（TG）及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平的升高，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平的降低，被认为是CAD 的独立危险因素，可导致动脉粥样硬化[4-5]。SREBPs 作为脂质合成转录因子，是处于调控脂质代谢核心的一类关键基因[6]，大量研究表明固醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element binding protein SREBPs）是导致脂质代谢紊乱的重要分子[7]。其中与胆固醇合成和摄取相关的基因，是由SREBP-2 控制的，而SREBP-1 主要调控脂肪生成关键酶[8-9]。

在本研究中，我们检测了CAD 患者SREBPs相对表达水平，以探讨其表达水平与冠心病并发高血压患者发病的相关性，以及与脂代谢紊乱的关系，旨在对CAD 并发高血压的早期诊断提供理论依据。

1 材料与方法

急性心力衰竭等其他系统严重性疾病。最终纳入CAD 患者196 例，根据患者血压和血脂水平，将患者分为CAD 并发高血压组（共126 例，平均年龄59.68±8.78 岁，其中男性76 例，女性50 例）和单纯CAD 组（共70 例，平均年龄57.73±10.27岁，其中男性51 例，女性19 例）。在体检中心选择178 例健康体检者作为对照组，平均年龄57.74±8.48 岁，其中男性106 例，女性72 例。三组研究对象间年龄、性别比较，差异无统计学意义，具有可比性（P> 0.05）。所有研究对象均签订知情同意书。使用SYNTAX 网页（www.syntaxscore.com）对CAD 并发高血压组126 例患者的造影结果进行评分：低危组0～22 分，中危组23 ～32 分，高危组≥33 分。其中0～22 分为低风险组，共71 例；≥ 33 分为高风险组，共55 例。

1.1 研究对象 选取2017年6月～2018年5月十堰市太和医院心内科经冠脉造影确诊为CAD 的患者为研究对象。诊断标准：高血压参照2018年修订版《中国高血压防治指南》[10]；血脂异常参照2016年修订版《中国成人血脂异常防治指南》[11]。冠心病患者纳入标准：一支及以上主冠状动脉狭窄> 70%，或左主冠状动脉狭窄≥50%。排除标准：既往有冠状动脉搭桥或冠状动脉支架植入手术史、陈旧性心肌梗死、严重心脏瓣膜疾病病史、

1.2 仪器与试剂 TRIZOL 试剂来自美国Invitrogen 公司，HiScript®Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR 试剂盒和ChamQTM SYBR®qPCR Master Mix 试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技有限公司。qPCR 引物购自武汉天一辉远生物科技有限公司。ABI ViiA7实时荧光定量PCR 仪来自美国Life 公司。TC，TG，HDL-C，LDL-C，脂蛋白a[LP（a）]和天冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒购自北京九强生物技术股份有限公司；Apo-A1， Apo-B，高敏C-反应蛋白（hs-CRP）和同型半胱氨酸（HCY）采用重庆中元生物技术有限公司试剂盒检测；肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）和羟丁酸脱氢酶（HBDH）试剂盒购自北京利德曼生化股份有限公司；胱抑素C（Cys-C）和糖化血清蛋白（GSP）采用浙江夸克生物科技有限公司试剂盒检测。以上生化指标的检测均采用德国西门子生物医疗电子有限公司ADVIA 2400 全自动生化分析仪。

1.3 方法

1.3.1 生化代谢指标检测： 所需检测的血清/血浆样品冻存于-80 ℃，所有指标的检测均在十堰市太和医院中心实验室通过标准技术进行。

1.3.2 SREBPs 相对表达水平检测：使用TRIZOL法提取外周血白细胞总RNA，取1 μg 总RNA 经42℃ 2min，50℃ 15min，85℃ 5s 逆转录为cDNA，以cDNA 为模板采用SYBR Green I 进行实时荧光定量PCR 反应，PCR 引物序列见表1。

表1 qPCR 引物序列

反应条件为95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，62 ℃ 34 s，72℃ 1 min，40 个循环，采用2－△△Ct进行结果分析及计算。

1.4 统计学分析 采用SPSS17.0 软件（Chicago，美国）进行数据统计分析。符合正态分布的计量资料采用均值±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK 法检验；非正态分布的计量资料采用中位数[四分位数间距]表示，组间比较采用非参数检验。分类变量采用卡方检验。运用Pearson（符合正态分布的计量资料）或Spearman（非正态分布的计量资料）分析SREBPs 与各生化代谢指标之间的相关性，采用ROC 曲线及曲线下面积反映SREBPs 相对表达水平在CAD 诊断中的准确性（0.7～0.9 表示有一定准确性，0.9 ～1.0 表示准确性较高）。P< 0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组研究对象各生化指标结果比较 见表2。单 纯CAD 组TC，HDL-C，LDL-C，Apo-A1 和Apo-B 水平均低于对照组，差异均具有统计学意义（均P< 0.001）；CAD 并发高血压组LP(a)高于对照组，而TC，HDL-C，LDL-C，Apo-A1 和Apo-B水平均低于对照组，差异均有统计学意义（均P<0.001）。相较于对照组，单纯CAD 组及CAD 并发高血压组hs-CRP 和CK-MB 增高，差异具有统计学意义（均P< 0.001）。

表2 对照组、单纯CAD 组和CAD 合并高血压组间各生化指标结果比较

2.2 SREBPs mRNA 表达水平 见图1。单纯CAD 组SREBP-1 及SREBP-2 mRNA 表达水平与对照组比较，差异无统计学意义（均P> 0.05），而CAD 并发高血压组SREBP-1 mRNA 表达水平低于对照组及单纯CAD 组，差异有统计学意义（均P<0.05）。

图1 三组SREBPs mRNA 表达水平散点图

2.3 SREBPs mRNA 表达水平与各生化指标的相关性 见表3。分析所有研究对象的SREBPs 相对表达水平与各生化代谢指标的相关性，结果显示SREBP-1 与TC，LDL-C，HDL-C，Apo-A1，Apo-B，CysC 和GSP 呈正相关（均P< 0.05），与CK-MB，HBDH，hs-CRP 和HCY 呈负相关（均P< 0.05）。SREBP-2 与AST，LDH，HBDH 呈负相关（均P< 0.05）。

表3 SREBPs 相对表达水平与各生化代谢指标的相关性分析

2.4 对照组及CAD 并发高血压组SREBP-1 mRNA表达与血压水平的相关性 见图2。将对照组及CAD 并发高血压组SREBP-1 分别与各组的舒张压及收缩压做相关性分析，两组研究对象中SREBP-1与舒张压及收缩压均无相关性（均P> 0.05）。

图2 SREBP-1 与血压相关性散点图

2.5 SREBP-1 mRNA 表达水平与CAD 并发高血压的相关性 见表4。为了探究SREBP-1 mRNA 表达水平与CAD 相关性，在校正了相关混杂因素后进行多因素Logistic 回归分析。结果所示，SREBP-1是CAD 并发高血压的独立风险因素，OR = 0.210，95% CI = 0.079～0.561（P= 0.002），与年龄、性别、糖尿病及高脂血症无关。

表4 SREBP-1 mRNA 表达水平与CAD 并发高血压组风险因素分析

2.6 SREBP-1 mRNA 表达水平在CAD 并发高血压中的诊断价值 见表5。采用ROC 曲线分析低风险组和高风险组的SREBP-1 表达水平，同时将SREBP-1 分别与血脂（TC，TG，HDL，LDL）进行联合分析。结果显示SREBP-1 单独作为预测CAD 并发高血压严重程度的指标时，AUC 面积及敏感度较低，AUC 为0.580(0.503～0.657），敏感度为38.9%（P= 0.045）；联合TC 时敏感度较高，特异度不高，AUC 为0.600(0.522～0.677），敏感度为86.3%，特异度为33.3%（P= 0.013）；联合HDL 后敏感度不高，特异度较高，AUC 为0.603(0.527～0.679），敏感度为38.9%，特异度为78.2%（P= 0.010）。

表5 外周血白细胞SREBP-1 mRNA 表达水平用来预测CAD 并发高血压危险程度的ROC 曲线分析结果

3 讨论

CAD 是一种由遗传、环境等多因素和多机制参与的复杂心血管疾病。动脉粥样硬化作为一种慢性炎症性疾病，是CAD 的病理基础，其发生发展的过程涉及血管壁沉积的脂质、细胞因子、炎症因子等[12-13]。

脂质代谢紊乱是CAD 发病进程中的重要一环，过剩的脂质沉积在动脉管壁是导致动脉斑块形成的始动因素。脂质代谢受到一系列转录及转录后机制的调控。SREBPs 是位于内质网的细胞内胆固醇敏感的脂代谢调节转录因子，通过INSIGSREBP-SCAP 途径对胞内的胆固醇进行反馈调节。主要包含两个家族成员SREBP-1 和SREBP-2。其中SREBP-1 基因定位于17p11.2，其编码的转录因子SREBP-1 是控制脂肪生成的关键因子，可激活其下游效应器乙酰辅酶A（CoA）羧化酶、脂肪酸合成酶、硬脂酰辅酶A 去饱和酶和甘油3-磷酸酰基转移酶，调控脂肪酸和三酰甘油的代谢[14-16]。SREBP-2 基因定位于22q13.2，其编码的转录因子SREBP-2 是调节胆固醇代谢的主转录因子，对参与胆固醇生物合成的基因具有高选择性[17-18]，例如羟甲基戊二酰（hydroxymethylglutaryl，HMG）-CoA合酶、HMG-CoA 还原酶、法呢酰焦磷酸合成酶、角鲨烯合成酶和低密度脂蛋白受体。这些转录因子增加缺乏脂质的细胞内胆固醇和脂肪酸的合成和摄取[19]。

本研究发现，与健康对照者和单纯CAD 患者相比，CAD 并发高血压患者SREBP-1 表达水平显著降低。从转录水平上来说，SREBP-1 mRNA 可以在胰岛素的刺激下激活肝脏X 受体对其的转录调控，同时SREBP-1 本身的调控也存在负反馈调控环路，此外,PI3K/SKT/mTORC1 通路可以激活SREBP 的表达，促进其对脂质代谢的调控[20]。作为脂质调控通路特别是脂肪酸和三酰甘油代谢中重要的转录因子，下调的SREBP-1 可能与高血压CAD 患者血浆中增高的TG 水平有关；另外一个重要的原因可能是脂质的堆积阻滞了SREBP-SCAP符合体的转运和剪切成熟，从而破坏了细胞脂质代谢的稳态；过量的脂质并未有效地激活SREBP 的表达。

高血压及血脂代谢紊乱是CAD 的独立风险因素[3]。有证据表明血脂异常和高血压的发生密切关联[21]。高血压患者血压升高，导致内皮细胞损伤，血小板和单核细胞黏附于血管壁上，内膜表面不平滑，导致更多的血小板和单核细胞黏附聚集在内膜上，这些黏附物释放生长因子，与炎症因子及沉积的脂质联合触发动脉粥样斑块的形成；血压升高造成微血管病变，进而导致冠脉储备能力下降，诱发冠脉病变。随着高血压患病时间的延长，动脉硬度增加，顺应性降低，动脉硬化性心脑血管病的发生率显著增加[22]。HALPERIN 等[23]报道，与具有最低五分位数（0～20%）的TC，非HDL-C 和TC / HDL-C比例的男性相比，具有最高五分位数（80%～100%）的男性患高血压风险比例分别增加23%，39%和54%。VALLE 等[24]研究发现重组松弛素Serelaxin可以减轻心肌缺血/再灌注损伤，WANG 等[25]进一步证明Serelaxin 通过下调SREBP-1c 和SREBP-2的表达来减少脂质积累，显著降低脱氧皮质酮醋酸盐大鼠的收缩压。此外，据报道SREBP 裂解激活蛋白（SREBP cleavage-activating protein，SCAP）的遗传多态性rs12487736 和rs12490383 与超重/肥胖的中国儿童的血压相关[26]。另有研究证实，纤维母细胞生长因子21（fibroblast growth factor 21，FGF21）的治疗性给药可能通过抑制SREBP-1 降低饮食诱导的肥胖小鼠血清和肝脏三酰甘油水平并改善脂肪肝。用FGF21 治疗4 周后肥胖小鼠的血压恢复正常，同时改善高血压大鼠血清脂质谱[27-29]。LEE 等[30]通过致动脉粥样硬化饮食建立动脉粥样硬化小鼠模型，使用代谢和脂质组学分析发现小鼠的血清样本存在代谢紊乱。在致动脉粥样硬化饮食早期阶段（8 周），小鼠心脏中SREBP-1 表达水平升高；在连续喂养至25 周后，SREBP-1 表达呈下降趋势。以上研究均证明SREBP-1 可能参与高血压的发病机制。

在本研究中，我们发现SREBP-1 水平的降低是高血压CAD 的独立危险因素。在高风险复杂性CAD 患者中，SREBP-1 mRNA 的水平显著降低。因此我们推测异常的脂质代谢水平可能和高血压互为致病促进因子。然而在对SREBP-1 mRNA 表达水平与血压进行关联性分析后，我们发现两者并没有统计学意义上的相关性，这一结果提示高血压和脂质代谢可能具有复杂的调控关系，在心血管疾病的发生机制中可能构建了调控网络中重要的一环。此外本研究存在的局限性也可能对血压和SREBP-1基因表达的关联产生了影响：样本量较少；缺乏对于冠心病疾病严重程度的分层研究；研究对象使用药物对于结果潜在的影响。这些内容需在下一步的研究中加以完善。