单采献血者IL-28b基因多态性与隐匿性HBV感染相关性研究

周 娟，竺 青，孙桂芝，张红卫，郭成山，贺韦东，陈 敏

（1.山东省血液中心机采科，济南 250014；2.深圳市宝安区人民医院，广东深圳 518101）

我国是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染高发区，HBV 感染不仅可导致急性慢性病毒性肝炎，同时与肝硬化和肝细胞癌的发生发展密切相关，严重影响人类健康[1]。隐匿性HBV感染（occult hepatitis B virus infection，OBI） 即血清或肝组织中乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）检测阴性而实时荧光定量PCR（real-time quantitative，RT-qPCR）技术检测HBV 阳性[2-3]。OBI 是HBV 感染的一种特殊类型，可通过输血、器官移植、血液透析等方式传播，是导致HBV 感染发生典型乙型肝炎的主要原因之一[4]。目前研究认为OBI 可能与HBV S 基因等基因突变有关[5]，白细胞介素-28b（interleukin-28b，IL-28b）是一种重要细胞因子，在HBV 感染进程中发挥重要作用，其基因多态性与乙型肝炎病程密切相关[6-7]，但关于其rs8099917 位点、rs12979860 位点多态性与OBI 的关系尚鲜有研究。因此本研究以单采献血者为研究对象，探究OBI 与IL-28b 基因rs8099917位点、rs12979860 位点多态性的关系，以期为临床OBI 发生发展机制研究提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2016年1月～2019年12月山东省血液中心成功捐献血小板的献血者1 158 例为研究对象。纳入标准：①年龄18～55 岁；②均经酶免疫检测和核酸检测HBsAg、丙肝病毒检测（hepatitis c virus，HCV）和人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）阴性合格者；③无血缘关系的本地常住居民；④至少成功捐献1 次血小板者。本研究经过山东省血液中心道德伦理委员会批准通过。

1.2 主要仪器及试剂 血清乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、表面抗体（hepatitis B surface antibody，HBsAb）、e 抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）、e 抗体（hepatitis B e antibody，HBeAb）和核心抗体（hepatitis B core antibody，HBcAb），试剂盒货号:YZB/国3575-2014，国食药监械（准）字2014 第3401094 号，购自深圳迈瑞生物医疗；DNA 提取试剂盒（货号：DP348）购自北京雅安达生物技术有限公司；PureLink PCR 纯化试剂盒（货号：K310001）购自美国Thermo Fisher 公司；cobas HBV 定量核酸检测试剂盒购自罗氏公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；Architect 分析仪购自美国雅培公司；7500 RT-qPCR 仪购自Thermofisher 公司等。

1.3 方法

1.3.1 资料收集: 收集每个献血者献血时性别、年龄、体质量指数、献血状态等临床资料及血液标本。

1.3.2 血清学指标检测:使用Architect 分析仪采用自动化化学发光酶免疫分析法对献血者进行HBsAg、抗HCV 抗体和抗HIV 抗体检测。使用化学发光免疫分析法对检测结果为阴性的受试者进行anti-HBs 和anti-HBc 的进一步检测。anti-HBs ≥10.0 mIU/ml 和anti-HBc ≥1.0 s/CO 滴度时为阳性。

1.3.3 DNA 提取及IL-28b 基因多态性检测 :采用全基因组DNA 提取试剂盒提取所有献血者血液DNA，置于-20℃冰箱保存备用。IL-28b 基因rs 8099917 位点上游引物序列（5’→3’）：TTCA CCATCCTCCTCTCATCCCTCAT，下游引物序列（5’ →3’）：TCCTAAATTGACGGGCCATCT；rs12979860 位点上游引物序列（5’→3’）：CTTAT CGCATACGGCTAGGCGTTTC，下游引物序列（5’→3’）：GGACCGCTACGTAAGTCACC。反应条件：95℃ 预变性5 min；95℃变性30 s，64℃退火1 min，72℃延伸30 s，35 个循环；72℃终延伸10 min。PCR 产物置于4℃保存。采用DNA 纯化回收试剂盒纯化回收后送上海生工生物工程股份有限公司进行基因测序。

1.3.4 HBV-DNA 病毒载量检测:采用cobas HBV定量核酸检测试剂盒检测献血者血液HBV-DNA 载量，具体操作参照试剂盒说明书进行。

1.4 统计学分析 采用SPSS 25.0 版软件进行统计学分析。计数资料以n（%）表示，采用χ2或Fisher 确切概率法检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组比较采用t检验。采用Pearsonχ2检验IL-28b 基因rs8099917 位点、rs12979860位点哈代-温伯格（Hardy-Weinberg）平衡。采用Logistic 回归分析影响OBI 发生的因素。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR 扩增结果分析 见图1。PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，产物条带单一，产量高且无明显引物二聚体。

图1 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳图

2.2 OBI 与非OBI 献血者IL-28b 基因多态性Hardy-Weinberg 平衡检验 1 158 例单采献血者中anti-HBs 或（和）anti-HBc 阳性者301 例（25.99%），其 中18～30 岁133 例（11.48%），31～49 岁100例（8.64%），50～55 岁68 例（5.87%）。进一步进行HBV-DNA 检测发现301 例献血者中HBVDNA 阳性即OBI 者46 例（15.28%），非OBI 者255 例（84.72%）。OBI 与非OBI 献血者IL-28b基因rs8099917 位点、rs12979860 位点基因型分布均符合哈代-温伯格（Hardy-Weinberg）平衡定律（χ2=4.589，0.812 和3.535，4.889，P=0.101，0.666和0.171，0.087），具有群体代表性。

2.3 OBI 与非OBI 献血者IL-28b 基因rs8099917位点、rs12979860 位点多态性 见表1。与非OBI比较，OBI 献血者IL-28b 基因rs8099917 位点G 等位基因频率、TG+GG 基因型频率显著降低，T 等位基因频率、TT 基因型频率显著增加（P＜0.01）；rs12979860 位点T 等位基因频率、CT+TT 基因型频率显著降低，C 等位基因频率、CC 基因型频率显著增加，以上比较差异均有统计学意义。

表1 IL-28b 基因rs8099917 位点、rs12979860 位点等位基因、基因型分布[%（n）]

2.4 OBI 献血者IL-28b 基因rs8099917 位点、rs12979860 位点多态性与HBV-DNA 载量的关系 见表2。OBI 献血者IL-28b 基因rs8099917 位点、rs12979860 位点多态性与HBV-DNA 载量有关（P＜0.01），其中rs8099917 位点，与TT 基因型比较，TG+GG 基因型患者HBV-DNA 载量显著降低（P＜0.01）；rs12979860 位点，与CC 基因型比较，CT+TT 基因患者HBV-DNA 载量显著降低，以上比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。

表2 OBI 献血者IL-28b 基因rs8099917 位点、rs12979860 位点多态性与HBV-DNA 载量关系（±s）

表2 OBI 献血者IL-28b 基因rs8099917 位点、rs12979860 位点多态性与HBV-DNA 载量关系（±s）

基因型nHBV-DNA（IU/ml）tP rs8099917 TT3713.76±1.42 5.2570.000 TG+GG911.03±1.29 rs12979860 CC3528.94±2.41 17.3980.000 CT+TT1115.37±1.63

2.5 IL-28b 基因rs8099917 位点、rs12979860 位点多态性与OBI 发生的关系 见表3。采用Logistic 回归分析IL-28b 基因rs8099917 位点、rs12979860 位点多态性与OBI 发生的关系，结果显示，rs8099917位点，与TT 基因型比较，TG+GG 基因型可显著降低OBI 发生风险（P＜0.05）；rs12979860 位点，与CC 基因型比较，CT+TT 基因型可显著降低OBI发生风险（P＜0.05）。

表3 IL-28b 基因rs8099917 位点、rs12979860 位点多态性与OBI 发生Logistic 回归分析

3 讨论

近年来尽管随着核酸检测（nucleic acid testing，NAT）技术的发展普及，HBsAg（-）/HBV-DNA（+）血样检出率显著提高，可在一定程度上降低HBV输血传播风险，但NAT 检测存在窗口期，对于感染HBV 40 天内患者其检出率极低[8-9]，另HBV S基因存在免疫逃逸突变等特点[10-11]，临床应用存在一定局限。有研究报道，高流行区70%～90%人口先前暴露于HBV 流行区供血者中，OBI 发生率可达7%～19%，而低流行区也有近0%～9%OBI患者[12-13]。本研究结果显示，1 158 例单采献血者中anti-HBs 或（和）anti-HBc 阳性者301 例，占25.99%，进一步进行HBV-DNA 检测发现301 例献血者中HBV-DNA 阳性即OBI 者46 例，高达15.28%，非OBI 者255 例，占84.72%。本研究结果与上述有关研究结果存在一定的冲突，导致此种现象的原因可能是由于纳入样本量不同以及研究地区不同导致结果存在一定的差异，同时也提示我们对单采献血者仅采用常规检测方法可能存在OBI 漏诊或误诊的风险，因此急需寻找灵敏度高的检测手段加以辅助，另探究OBI 发生机制可能对减少OBI发生及增加其检出率具有重要意义。

研究发现，宿主年龄、性别及基因多态性可能影响其抵抗HBV 感染的效果[14]，IL-28b 基因编码的λ3 干扰素具有抗病毒及免疫调节等生物作用，IL-28b 基因变异，其中位于其启动子上游8 kb的rs8099917 位点及基因上游3 kb 的rs12979860位点与丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、HBV 对感染后自发清除及对干扰素治疗应答效果密切相关[15-16]。LI 等[17]研究报道，IL-28b 基因变异与HBV 病毒载量和肝脏炎症有关，IL-28b 基因rs12979860 位点、rs12980275 位点及rs8099917 变异可能通过降低病毒载量和肝脏炎症来阻止HBV进展。谈国蕾等[18]研究报道，江苏地区汉族人群IL-28b 基因多态性与HBV 感染后不同疾病表型相关，IL-28b 基因rs12979860 位点C 等位基因和rs8099917 位点T 等位基因可能是促进HBV 感染后病情进展的影响因素。基于此，本研究推测IL-28b基因rs12979860 位点及rs8099917 位点多态性可能与OBI 发生存在一定相关性。本研究结果发现，与非OBI 比较，OBI 献血者IL-28b 基因rs8099917位点G 等位基因频率、TT+GG 基因型频率显著降低，T 等位基因频率、TT 基因型频率显著增加；rs12979860 位点T 等位基因频率、CT+TT 基因型频率显著降低，C 等位基因频率、CC 基因型频率显著增加，且均与OBI 献血者HBV-DNA 载量有关，与谈国蕾等[18]研究基本相符，提示本研究推测正确，IL-28b 基因rs12979860 位点及rs8099917 位点多态性与OBI 发生发展及HBV 感染有关。

为进一步探究IL-28b 基因rs8099917 位点、rs12979860 位点多态性与OBI 发生的关系，本研究采用Logistic 回归分析，结果发现，rs8099917 位点，与TT 基因型比较，TG+GG 基因型可显著降低OBI发生风险；rs12979860 位点，与CC 基因型比较，CT+TT 基因型可显著降低OBI 发生风险，提示检测IL-28b 基因rs8099917 位点、rs12979860 位点多态性可能对OBI 发生评估及对其检出率增加有一定辅助作用，可能对临床应用有一定参考价值。

综上所述，单采献血者中OBI 可能与IL-28b基因rs8099917 位点、rs12979860 位点多态性有关，本研究可能对OBI 治疗及检出提供了一个有价值的基因工具。但关于IL-28b 基因rs8099917 位点、rs12979860 位点多态性与OBI 发生发展的关系可能会受到不同地区种族遗传结构及样本量选择的影响，具体机制也尚不明确，可能导致结果存在一定偏倚，提示后期应扩大样本量，采取多中心全方面的研究，同时也提示在临床输血中应严格掌握用血适应症，提倡对患者实施自体输血，以减少感染发生。