功能性调味黑蒜液加工中品质变化研究

时培宁，谭笑，李莹，李勇,2，赵节昌,2，贺羽,2，王帅,2*

(1.徐州工程学院 食品(生物)工程学院，江苏 徐州 221018；2.徐州工程学院江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏 徐州 221018)

鲜蒜又称葫或麝香草，属百合科葱属植物蒜的鳞茎，其中主要的成分有水分、糖类、蛋白质、脂肪等，在日常生活中可食用也可作为常用的调味佳品[1]。鲜蒜中还含有多种人体必需的微量元素，主要的一些元素有锰、锌、铜、锗、硒等，这些微量元素是其在人体生命活动中发挥着重要生理功能的主要原因之一[2]。研究发现，蒜具有抗癌、降低心血管疾病风险、增强免疫力、抗流感、抑制幽门螺杆菌等功效，可作为辅助药物与常规治疗药物共同使用[3-7]。随着时代的进步，人们对大蒜滋味的要求也在不断地提高，由于大蒜有一股特殊的刺激性味道，即蒜臭味，使大蒜在消费上受到了很大程度的限制。但是大蒜不仅产量丰厚、价格低廉，还含有各种营养成分及生理功能，所以就有了许多大蒜的加工工艺，增加了大蒜产品的附加值，给予人们更多的选择。

与鲜蒜相比，黑蒜是一种发酵食品，去除了辛辣的蒜味儿，口感软糯，带有甜味，可直接食用，其药用价值、营养价值和保健功能相较于鲜蒜都有巨大的提升[8]。祝炳俏等用黑蒜和鲜蒜对小鼠进行动物试验，结果表明，黑蒜能降低小白鼠体内丙二醛的含量，抗氧化酶活性显著提高，表现出了较强的抗氧化功能[9]。黑蒜中含有的锗元素能阻断致癌物质亚硝胺的生成与积累，能有效地抑制癌细胞生长[10]。大蒜素和白色油脂性液体硫化丙烯是黑蒜杀菌消炎作用的主要成分，对多种致病微生物都有杀菌作用。冯永辉等通过给小白鼠注射黑蒜提取物培养脾细胞，结果表明，黑蒜提取物能增强NK细胞杀伤活性，这说明黑蒜提取物对小鼠细胞免疫力具有一定的促进效果[11]。此外，黑蒜可阻止人体血液中的有害胆固醇与活性氧相结合，降低血清三酰甘油、低脂蛋白和胆固醇，影响脂质代谢，并且能够预防人体内动脉硬化，使人体全身血管流通顺畅[12]。

目前，黑蒜液主要集中在加工工艺的研究，对其滋味、风味品质的研究较少。本研究在保持黑蒜本身生理功能的前提下，将黑蒜加工成黑蒜液，可用作调味料或直接饮用，既方便又健康安全。通过对鲜蒜、黑蒜和黑蒜液的总酚含量及其抗氧化活性检测、滋味总酸及还原糖含量的测定、游离氨基酸的测定和挥发性风味物质的测定进行品质研究，为黑蒜液的进一步开发利用做准备。

1 原料与设备

1.1 实验材料与试剂

实验原料：鲜蒜、黑蒜、黑蒜液皆由徐州某黑蒜加工企业提供，采用徐州邳州本地的多瓣蒜，从鲜蒜到黑蒜再到黑蒜液跟踪同一批蒜。

1.2 主要仪器与设备

JA2104N型电子天平、超低温冰箱、数显式电热恒温水浴锅、6890A-5975C气相色谱-质谱联用仪、L800氨基酸自动分析仪、超声波清洗器、双光束紫外分光光度计、台式低速离心机、720 nm分光光度计。

2 实验方法

2.1 黑蒜液总酚含量及抗氧化活性的测定

2.1.1 总酚含量的测定

本实验采用Folin-Ciocalteu法测定总酚含量[13]，配制0.1 g/L没食子酸标准溶液，利用分光光度计测定765 nm处的吸光值，以吸光度值为纵坐标，没食子酸浓度(μg/mL)为横坐标，绘制没食子酸溶液标准曲线，求得回归方程。

分别取5 g鲜蒜和黑蒜，于研钵中进行充分研磨，然后用100 mL容量瓶定容，摇匀后用滤纸进行过滤处理，滤液备用。黑蒜液过滤后备用，用移液管分别吸取5 mL滤液，按照上述测定没食子酸标准曲线的方法测定吸光值的步骤依次加入试剂，静置，定容，水浴加热，再静置，测吸光度值，然后计算样品中总酚的含量，见公式(1)：

总酚含量/(μg/g)=相当于标准酚的含量(μg)/样品含量(g)。

(1)

2.1.2 抗氧化活性的测定

分别取5 g鲜蒜和黑蒜，于研钵中进行充分研磨，然后用100 mL容量瓶定容，摇匀后用滤纸进行过滤处理，滤液备用，黑蒜液过滤后备用。分别取各样品溶液0.5 mL于50 mL离心管中,加入3.0 mL浓度为0.004%的DPPH溶液(精密称取DPPH 0.197 g，用无水乙醇溶解并定容至250 mL棕色容量瓶中，低温避光保存)，室温避光反应静置30 min，测定上清液在517 nm波长下的吸光度,以无水乙醇为空白[14]。按公式(2)计算各样品的DPPH自由基清除率。

(2)

式中：A0为1.0 mL蒸馏水加3.0 mL DPPH溶液的吸光度值；As为1.0 mL样品溶液加3.0 mL DPPH溶液的吸光度值；Ac为1.0 mL样品溶液加3.0 mL无水乙醇的吸光度值。

超氧自由基 (O2-·) 清除作用的测定：采用邻苯三酚自氧化法。配制0.1 mol/L Tris溶液，pH 8.2 Tris-HCl缓冲液，25 mmol/L邻苯三酚溶液。取0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液4.0 mL置于试管中，于25 ℃水浴中保温20 min，分别加入不同种类2 mL样液和2 mL 25 mmol/L邻苯三酚溶液，混匀，再于25 ℃水浴中反应5 min，加入8%的HCl 1 mL终止反应，用分光光度计测定325 nm处的吸光度(A)，本实验以蒸馏水做空白。按照公式(3)计算各样品的超氧自由基清除率[15]。

(3)

式中：Ai为4 mL Tris-HCl+1 mL样液+2 mL邻苯三酚对应吸光度值；Aj为4 mL Tris-HCl+1 mL样液+2 mL蒸馏水对应的吸光度值；Ac为4 mL Tris-HCl+1 mL蒸馏水+2 mL邻苯三酚对应的吸光度值。

2.2 黑蒜液滋味的研究

2.2.1 黑蒜液总酸含量的测定

分别取5 g鲜蒜和黑蒜，于研钵中进行充分研磨，然后用100 mL容量瓶定容，摇匀后用滤纸进行过滤处理，滤液备用，黑蒜液过滤后备用。酚酞指示剂准确称取 0.1 g酚酞，溶于 250 mL 70%乙醇中。分别吸取样品5 mL置于250 mL三角瓶中，再倒入50 mL蒸馏水，滴入3滴酚酞指示剂，用0.1 mol/L的氢氧化钠标准溶液进行滴定，直至溶液出现红色，且30 s内不褪色，记录氢氧化钠标准溶液消耗的体积数。按照公式(4)计算各样品的总酸含量。

(4)

式中：V1为消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，mL;V2为样品的体积，mL；V3为吸取样品的体积，mL；c为氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；m为称取样品的重量，g；0.090为乳酸的摩尔质量，kg/mol。

2.2.2 黑蒜液还原糖含量的测定

本实验采用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖[16]。分别配制1 mg/mL葡萄糖标准溶液，3,5-二硝基水杨酸溶液(DNS)。分别取5 g鲜蒜和黑蒜，于研钵中进行充分研磨，然后用100 mL容量瓶定容，摇匀后用滤纸进行过滤处理，滤液备用。以540 nm处的吸光度值为纵坐标，葡萄糖含量(mg)为横坐标，绘制出葡萄糖溶液标准曲线的图，求得葡萄糖标准溶液的线性回归方程。

取3支25 mL刻度试管，编号，分别加入还原糖待测液0.5 mL、3,5-二硝基水杨酸试剂1.5 mL, 将各管摇晃均匀，在沸水浴的条件下，5 min时间精确加热，加热后取出立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，将溶液转移至25 mL容量瓶中，加入蒸馏水定容至刻度线，摇晃均匀。在分光光度计上进行吸光度的测量，测定各样品的吸光度值。结合标准曲线按照公式(5)计算各样品的还原糖含量。

(5)

式中：n为由回归方程求得的还原糖的量，mg/mL；V1为提取液的体积，mL；V2为显色时取用体积，mL。

2.2.3 黑蒜液游离氨基酸含量的测定[17]

量取(2.00±0.05) g样品，放入研钵中，准确量取15 mL冷却过的5%三氯乙酸溶液(TCA)，放在研钵中，用研磨棒充分研磨后，再经过5 min超声波清洗器的超声，然后静置1 h，使沉淀分层，用移液管吸取10 mL上清液，置于离心管中，放置在冷冻离心机(4 ℃，3000 r/min)中，冷冻离心30 min。再次用移液管吸取5 mL上清液，缓慢加入配制的浓度为6 mol/L的氢氧化钠溶液，同时用pH计调整混合溶液的pH值到2.0，然后转移到10 mL容量瓶中，加入蒸馏水定容至刻度线，用移液管移取适量的溶液，用0.45 μm的微孔过滤膜过滤后待测，最后用氨基酸自动分析仪(570，440 nm的脯氨酸)进行测定。

2.3 黑蒜液挥发性风味物质的测定

参考张中义等[18]的方法进行改进。分别称取各样品2 g于研钵中，用研磨棒充分研磨后，放入顶空瓶中，放入水浴锅内，恒温水浴平衡(50 ℃)30 min。选取色谱柱65 μm的型号为PDMS/DVB的萃取头，将萃取头放在气相色谱的进样口处，在250 ℃的条件下老化30 min，然后将老化后的萃取头插入顶空瓶，再在水浴锅内(50 ℃)萃取30 min。萃取结束后，立刻进入GC进样口计时并解吸5 min，完成GC-MS的分析。

2.3.1 GC-MS方法色谱条件

色谱柱：型号为DB-5MS的毛细管柱(30 m×0.25 nm×0.25 μm)；设置进样口温度为280 ℃；设置起始柱箱温度为40 ℃，保持2 min，再以3 ℃/min的速率升至90 ℃保持1 min，再以6 ℃/min的速率升至120 ℃保持2 min，最后以10 ℃/min的速率升至280 ℃；其中载气为He，流速设置为1 mL/min；进样量设为1 μL，不分流。

2.3.2 GC-MS方法质谱条件

设置连接口温度为300 ℃；以EI的电离方式；设置电子能量为70 eV；四极杆温度为150 ℃；离子源温度为230 ℃；质量扫描范围为33～550 amu。数据分析时，以 NIST 8谱库为检索谱，本研究以测定各样品挥发性物质的峰面积为基准，通过单一物质的峰面积与总峰面积的比值采用面积归一化法进行定量分析。

3 结果与分析

3.1 黑蒜液总酚含量及抗氧化活性的测定

3.1.1 总酚含量的测定

根据实验得出没食子酸溶液标准曲线的线性回归方程为：Y=1.5723x+0.0579，r2=0.9955，r=0.9977。由标准曲线计算得样品总酚含量，见图1。

图1 总酚含量Fig.1 The content of total phenols

由图1可知，黑蒜相较于鲜蒜总酚含量高出5倍以上，其中的巯基和亲电子基团有清除活性氧和自由基的作用，所以，酚类物质是黑蒜中重要的功能性物质，是黑蒜品质的重要指标，总酚含量的变化，既有大分子酚类物质的降解，也有其他物质的转化，总酚含量的升高使黑蒜具有更好的抗氧化活性，朱新等的研究也验证了这一观点[19]，黑蒜的总酚含量明显比鲜蒜多。而黑蒜液，作为黑蒜的再加工产品，其中总酚含量有所提升，所以黑蒜液的总酚含量比黑蒜多，即黑蒜液的抗氧化、抗衰老能力好。

3.1.2 抗氧化活性的测定

各样品DPPH自由基清除能力见图2。

图2 DPPH自由基清除能力Fig.2 The scavenging ability of DPPH free radical

由图2可知，鲜蒜、黑蒜、黑蒜液这三者中黑蒜液的DPPH自由基清除能力最好，由于总酚中的巯基和亲电子基团具有清除自由基的功能，所以总酚的含量增加就间接导致了DPPH自由基清除能力的提高。而从鲜蒜到黑蒜再到黑蒜液这个加工过程中，由上述实验结果可知，总酚含量一直在增加，所以清除自由基的能力也一直在提高。

结果表明，黑蒜液的清除自由基能力最好，DPPH自由基清除率高达92.78%，抗氧化能力最强，能作为比较优良的保健产品，黑蒜的DPPH自由基的清除率是鲜蒜的3倍有余，郑岚等的研究表明[20]，黑蒜、鲜蒜的DPPH自由基清除率分别为(98.57±3.75) mg/L和 (28.33±1.10) mg/L，此研究也验证了黑蒜的DPPH自由基清除能力明显比鲜蒜强这一观点，而自由基清除率也与多方面有关，如总酚含量、多糖含量、pH等，所以结果存在差异是不可避免的。

由图3可知，鲜蒜、黑蒜、黑蒜液这三者中黑蒜液的超氧自由基清除能力最好，这与DPPH自由基清除率结论一样，由于总酚中的巯基和亲电子基团具有清除活性氧和自由基的功能，所以总酚含量的增加就间接导致了超氧自由基清除能力的提高，黑蒜的超氧自由基清除率是鲜蒜超氧自由基清除率的3倍有余，黑蒜液的超氧自由基清除率是鲜蒜超氧自由基清除率的4.7倍。而黑蒜液加工过程中，由上述实验结果可知，总酚含量一直在增加，所以清除活性氧和自由基的能力也一直在提高。张桂芝等的研究表明[21], 大蒜发酵过程中发生美拉德反应，产生的氨基酸、糖类、多酚和含硫化合物等含量增加，这是抗氧化能力显著提高的根本原因，同样也证明了黑蒜的抗氧化能力比大蒜强。结果表明，黑蒜液的清除超氧自由基能力最佳，抗氧化活性最强。

图3 超氧自由基清除能力Fig.3 The scavenging ability of superoxide radical

3.2 黑蒜液滋味的研究

3.2.1 黑蒜液总酸含量的测定

测得黑蒜液的总酸含量，见图4。

图4 总酸含量Fig.4 The content of total acids

由图4可知，鲜蒜的总酸含量比黑蒜少，说明黑蒜在加工过程中，美拉德反应生成的还原酮类化合物可以裂解产生酸，导致总酸含量明显增加[22]，从本实验数据来看，黑蒜的总酸含量是鲜蒜总酸含量的2.95倍。而黑蒜液是由黑蒜加工制成的，由柱状图中可知，黑蒜液的总酸含量比黑蒜要多，黑蒜液的总酸含量是黑蒜总酸含量的3.5倍，比鲜蒜要多得多，黑蒜液的总酸含量为鲜蒜总酸含量的10倍有余,说明在黑蒜加工成黑蒜液这一过程中，总酸含量明显提升。

总酸作为重要的食品感官指标，对黑蒜及其副产品的市场销售具有重大作用。总酸含量的多少决定着产品的口感，所以生产时往往关注黑蒜的总酸含量。

3.2.2 黑蒜液还原糖含量的测定

根据测得的葡萄糖标准溶液的光密度值可以得出葡萄糖标准曲线的线性回归方程：Y=0.1734x+0.0108，r2=0.9958，r=0.9979。

由图5可知，黑蒜液的还原糖含量是最高的，黑蒜的还原糖含量是鲜蒜还原糖含量的4倍有余，黑蒜液的还原糖含量约为鲜蒜还原糖含量的5倍，这一结论符合朱新鹏、王英美等的5种大蒜制备黑蒜的品质比较研究结果，黑蒜液的还原糖含量高于黑蒜的还原糖含量，但是差距不大。

图5 还原糖含量Fig.5 The content of reducing sugar

黑蒜变黑主要是酶促褐变和非酶褐变共同作用的结果，黑蒜在加工过程中，由于淀粉酶、果聚糖聚合酶的酶解作用及熟化过程中的热力作用，大蒜中的多聚糖逐渐分解为单糖、双糖，使黑蒜的甜度逐渐增加，其中还原糖和可溶性糖含量的变化与黑蒜中的功能性成分有着密切的关系[23]。还原糖含量是产品变黑的重要物质基础，还影响产品的口感，赋予黑蒜甜味感和焦香味，并与发酵产酸有关。黑蒜液是黑蒜加工浓缩成的液体，甜度增加，口感更甜。

3.2.3 黑蒜液游离氨基酸含量的测定

测定黑蒜中游离氨基酸成分，见表1。

表1 游离氨基酸含量Table 1 The content of free amino acids

由表1可知，鲜蒜中的游离氨基酸含量比黑蒜低，而黑蒜液的游离氨基酸中蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸的含量升高，一般在1.5～2.5倍左右，其他氨基酸含量在1.5～2.5倍范围内有不同程度的降低。异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸是人体必需的氨基酸，有促进生长发育的功能。因为鲜蒜的氨基酸含量比黑蒜少，所以人体必需的氨基酸含量就少，促进生长发育的效果没有黑蒜的好，而黑蒜液与黑蒜的人体必需氨基酸含量差距不大，效果也就差距不大。黑蒜液在加工中，游离氨基酸的含量总体在增加。异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸是果实合成香气物质的前体，在香气形成过程中积累，黑蒜液中这3种氨基酸的含量比鲜蒜和黑蒜多，黑蒜液在气味上比黑蒜和鲜蒜好[24]。

3.3 黑蒜液挥发性风味物质的测定

鲜蒜挥发性风味物质含量见表2。

表2 鲜蒜挥发性风味物质含量Table 2 The content of volatile flavor substances in fresh garlic

由表2可知，鲜蒜中含量较高的挥发性风味物质有二烯丙基二硫醚(45%)、3-乙烯基-1,2-二硫环己-4-烯(22.92%)、乙基硫脲(6.58%)、二烯丙基硫醚(6.11%)、二丙烯基三硫醚(4.55%)、3-乙烯基-1,2-二硫环己-5-烯(4.48%)等。大蒜具有刺激性气味和蒜臭味的主要原因是大蒜中的二烯丙基二硫醚具有刺激性气味，而二丙烯基三硫醚除了有刺激性气味之外，还有燃烧味和硫磺味[25]。

黑蒜挥发性风味物质含量见表3。

表3 黑蒜挥发性风味物质含量Table 3 The content of volatile flavor substances in black garlic

续 表

由表3可知，黑蒜中含量较高的挥发性风味物质有2,2-二甲基-1,3-二噻烷(32.88%)、二烯丙基硫醚(21.06%)、二烯丙基二硫醚(14.68%)、1,3-二噻烷(7.91%)、2-丙基噻吩(7.22%)、2-糠酸甲酯(5.86%)等。相较于大蒜，黑蒜没有蒜臭味和刺激性气味而具有香味和甜味的原因是具有刺激性气味的物质含量降低了，反而出现了鲜蒜没有的具有香味的吡嗪、噻吩、呋喃类物质，吡嗪类物质具有烤香味，噻吩类物质具有甜香味，呋喃类物质具有焦糖味、甜味。因为黑蒜中具有香味的挥发性物质较多，所以黑蒜的香味比较明显。

黑蒜液挥发性风味物质含量见表4。

表4 黑蒜液挥发性风味物质含量Table 4 The content of volatile flavor substances in black garlic liquid

由表4可知，黑蒜液中含量较高的挥发性风味物质有5-甲基糠醛(17.83%)、1,3,5-三噻烷(12.64%)、苯乙醛(10.77%)、二烯丙基二硫醚(9.83%)、2-糠酸甲酯(8.88%)等。相较于黑蒜，黑蒜液中具有刺激性气味的挥发性风味物质二烯丙基二硫醚的含量减少，具有香味的挥发性风味物质 1,3,5-三噻烷的含量增多，所以黑蒜液的香味较明显。

4 讨论

对于本次实验，采用鲜蒜、黑蒜、黑蒜液3种样品，测定黑蒜液在加工过程中滋味和风味上的品质变化。通过对鲜蒜、黑蒜、黑蒜液的总酚含量及其抗氧化活性的测定，得出它们的总酚含量依次为415.5，2138.8，2577.6 μg/g，DPPH自由基清除率依次为18.36%、57.12%、92.78%，超氧自由基清除率依次为4.7%、14.5%、21.9%。由此可得出结论：黑蒜液的总酚含量比鲜蒜和黑蒜多，黑蒜液的抗氧化活性比鲜蒜和黑蒜强，所以黑蒜液的抗氧化、抗衰老功能也是最好的。

对黑蒜液滋味上的研究选定总酸和还原糖，这两项指标也是最为重要的感官指标。以鲜蒜、黑蒜、黑蒜液作为原料，进行总酸含量和还原糖含量的测定，得出它们的总酸含量依次为1.8%、5.31%、18.63%，还原糖含量依次为4.71%、21.59%、23.8%。由此可得出结论：黑蒜液的总酸含量比鲜蒜和黑蒜多，黑蒜液的还原糖含量比鲜蒜和黑蒜多，黑蒜液不仅没有鲜蒜的辛辣，还没有黑蒜的微苦味，所以黑蒜液在口感上要比黑蒜和鲜蒜好。鲜蒜中的游离氨基酸含量比黑蒜低，而黑蒜液的游离氨基酸中蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸的含量升高，一般在1.5～2.5倍左右，其他氨基酸含量在1.5～2.5倍范围内有不同程度的降低，黑蒜液加工中游离氨基酸总含量一直在增加。

对黑蒜液挥发性风味物质的测量，采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用仪(SPME-GC-MS)测出鲜蒜、黑蒜和黑蒜液这3种样品中挥发性风味物质的成分和含量并进行分析，结果表明鲜蒜中具有刺激性气味的挥发性风味物质比较多，所以鲜蒜的刺激性气味比较明显，黑蒜中具有香味的挥发性物质多，所以黑蒜的香味比较明显。黑蒜液中具有刺激性气味的挥发性风味物质二烯丙基二硫醚的含量减少，具有香味的挥发性风味物质 1,3,5-三噻烷的含量增多，所以黑蒜液的香味较明显。