添加单宁酸对紫花苜蓿青贮品质及瘤胃体外产气量的影响

谢小来，马逢春，焦培鑫，扈光辉，陈明明，孙海霞

（1.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030；2.中国科学院东北地理与农业生态研究所，哈尔滨 150081）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是优质豆科牧草，营养价值丰富，粗蛋白质含量高。苜蓿通常以干草形式被利用，但其收获、贮存等受天气及环境湿度影响较大。青贮作为一种苜蓿贮存处理方式，受天气等因素影响较少，且适口性好，应用前景广泛。但苜蓿中可溶性碳水化合物含量较低，蛋白质含量较高，具有较高缓冲能，青贮过程中粗蛋白质降解严重[1]。因此，探究出一种提高苜蓿青贮品质、防止苜蓿粗蛋白质降解、延长苜蓿青贮保存时间的青贮添加剂具有重要意义。单宁酸是一种强极性物质，易与蛋白质结合生成络合物，具有防腐、杀菌作用[2]。袁英良等研究表明，在苜蓿草粉中添加单宁酸可显著提高反刍动物小肠消化率，有效保护过瘤胃蛋白[3]。丁学智研究发现，单宁酸可抑制瘤胃甲烷产气量，单宁酸添加浓度越高，抑制程度越好[4]。Avijit等研究发现，通过饲喂奶牛添加1.5%缩合单宁的孟加拉榕树叶可显著提高奶牛乳产量[5]。

目前单宁酸应用主要集中在反刍动物日粮，在苜蓿青贮方面研究较少。本试验通过添加不同水平单宁酸对紫花苜蓿进行青贮，旨在探讨单宁酸对紫花苜蓿青贮营养成分、pH、有机酸含量、蛋白质降解特性和微生物群落等影响，以筛选青贮效果最佳的单宁酸添加量，为单宁酸在紫花苜蓿青贮的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

紫花苜蓿，取自中国科学院东北地理与农业生态研究所种植基地（东经126°82′，北纬45°87′），于2020年10月11日9:00时 刈割。原料DM、CP、NDF和ADF含量分别为36.02%、24.36%、30.70%和18.44%（DM）。

单宁酸（Tannic acid），C76H52O46，为进口产品，纯度≥75%，粗纤维≤2%，粗灰分≤2%，水分≤6%，可溶性糖≤15%。

1.2 试验设计

试验采用单因素完全随机试验设计，按苜蓿干物质计，添加单宁酸水平为0、0.2、0.4和0.6 g·kg-1（单宁酸按商品质量计）即TA0、TA1、TA2、TA3，其中TA0为对照组，共4个处理，每个处理均设置3个重复，分别于15、30、40和60 d取样分析。

1.3 青贮制备

将苜蓿晾晒至水分60%，切碎至1~2 cm备用，将苜蓿平均分为4组，将单宁酸按照试验设计水平溶解于蒸馏水，均匀喷洒于苜蓿，对照组喷洒等量蒸馏水，均匀混合后使用真空青贮发酵袋（35 cm×25 cm）装入500 g原料，共4个处理。使用青贮真空包装机密封处理，室温（20~25℃）避光贮藏，于青贮后15、30、45和60 d取样，每次取3袋，采取随机开袋取样方式。

1.4 试验动物

选择3头健康状况良好、年龄均4岁、体重（550±50）kg、装有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛（干奶期）。每日07:00和18:00饲喂，自由饮水。试验日粮组成及营养水平见表1。

表1 试验日粮组成及营养水平（干物质基础）Table 1 Composition and nutrient levels of the experimental diet（DM basis） (%)

1.5 瘤胃体外产气量试验

选各组处理45 d苜蓿青贮样品，试验根据Menke等步骤操作[6]。准确称取5.00 g饲料组合样品（DM基础）装入纤维袋中（42 mm×53 mm；孔径38~45 μm），置于发酵管（100 mL玻璃注射器）底部。分别在3头瘘管奶牛不同瘤胃位点中取出瘤胃液，经4层纱布过滤后装入39℃预热好并充入CO2保温瓶中，配制参照Fievez等[7]，瘤胃液：人工唾液按1：2比例混合后制成人工瘤胃液，使用发酵管准确吸取30 mL人工瘤胃液，排去发酵管中气体，将发酵管底部胶塞密封，置于39℃水浴摇床中恒温培养48 h，分别在3、6、12、24和48 h时准确记录发酵管刻度示数，比较不同单宁酸添加水平瘤胃体外产气量。

1.6 测定指标及方法

1.6.1 营养指标测定

苜蓿青贮中营养指标参照《饲料分析及饲料质量检测技术》[8]测定。干物质（DM）采用烘干法测定；粗蛋白质（CP）采用凯氏定氮法测定；中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）采用ANKOM滤袋技术并通过酸碱处理法测定。

1.6.2 pH及有机酸测定

苜蓿青贮pH及有机酸参照国标法DB15/T 1458-2018测定。使用pH计测定青贮滤液pH；使用液相色谱法（Agilent 1260 Pre高效液相色谱仪）测定乳酸（LA）、乙酸（AA）、丙酸（PrA）、丁酸（BA）含量，色谱柱为Agilent Inc.C18柱（4.6×250 mm，5 μm）。

1.6.3 氮组分测定

粗蛋白质（CP）采用凯氏定氮法测定；非蛋白氮（NPN）采用三氯乙酸沉降法测定；氨态氮（NH3-N）采用苯酚－次氯酸钠比色法测定；游离氨基酸态氮（FAA-N）采用茚三酮硫酸肼比色法测定；肽氮（Peptide-N）含量通过计算得出，计算方法为：

肽氮（Pep-N）=非蛋白氮（NPN）-氨态氮（NH3-N）-游离氨基酸态氮（FAA-N）。

1.6.4 微生物菌群测定

选用取样时间0、15、30和45 d各处理组，使用TIANamp Soil DNA Kit试剂盒提取DNA，利用紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度，确定OD260/OD280为1.7~1.9。通过实时荧光定量PCR技术测定微生物菌群，针对细菌16S rRNA基因V3~V4区域作聚合酶链反应扩增，扩增长度468 bp，使用引物341F（5'ACTCCTACGGGAGGCAGCAG 3'）和806R（5'GGACTACHVGGGTWTCTAAT 3'）扩 增 细 菌16S rRNA基因V3~V4区，反应体系（50 μL）为：5×PS GXL Buffer 10 μL，Input DNA 2 μL，P5 1 μL，P7 1 μL，Prime STAR GXL 1 μL，dNTP MIX 4 μL，H2O 31 μL；扩增参数为：预变性95℃3 min，变性95℃45 s，退火47℃45 s，延伸72℃45 s，35个循环，延伸72℃10 min；文库采用NGS™dsD⁃NA HS检测试剂盒，使用Qubit®3.0荧光仪进行定量。最后在illumina Hiseq平台250 bp模式对文库进行测序。

1.6.5 瘤胃体外产气量测定

产气量计算公式为：

式中，Gpt为样品在t时刻产气量（mL）；Vt为样品发酵t小时后培养管刻度；V0为样品开始培养时，空白培养管刻度读数；W为样品干物质重量（mg）。

1.7 数据处理与统计分析

数据采用Excel 2013软件记录整理，SPSS 26.0软件统计，one-way ANOVA analysis作方差分析，并用Duncan's方法对各组平均数多重比较，数据用平均值±标准差表示，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同单宁酸添加量对紫花苜蓿青贮营养成分的影响

由表2可知，TA1、TA2、TA3组DM含量在不同取样时间内均显著高于TA0组（P<0.05），取样时间为15和60 d时，TA1、TA2、TA3组DM含量差异不显著（P>0.05），取样时间为30和45 d时，DM含量由高到低依次为TA1>AT2>AT3>TA0，TA1、TA2组差异不显著（P>0.05）。取样时间为15 d时，各处理组CP含量差异不显著（P>0.05）；取样时间为30、45和60 d时，TA1、TA2、TA3组CP含量显著高于TA0组（P<0.05）。NDF、ADF含量在各取样时间内差异均不显著（P>0.05）。

表2 不同单宁酸添加量对紫花苜蓿青贮营养成分的影响(干物质基础)Table 2 Effects of different tannic acid additions on nutritional components of alfalfa silage（DM basis） (%)

2.2 不同单宁酸添加量对紫花苜蓿青贮pH及有机酸的影响

不同单宁酸添加量对紫花苜蓿青贮pH及有机酸的影响如表3所示。可知，在取样时间为15、30、45和60 d时，TA1、TA2、TA3组pH、LA含量显著低于TA0组（P<0.05），TA3组AA含量显著低于TA0、TA1、TA2组（P<0.05），随单宁酸添加量增加LA、AA含量显著降低（P<0.05）。各处理组均未检测到PrA。TA0组仅在60 d时检测到少量BA。

表3 不同单宁酸添加量对紫花苜蓿青贮pH及有机酸的影响Table 3 Effects of different tannic acid additions on alfalfa silage pH and organic acids

2.3 不同单宁酸添加量对紫花苜蓿青贮氮组分的影响

由图1可知，随取样时间增加，各组NPN、NH3-N、FAA-N含量均上升，Pep-N含量呈先升后降趋势，单宁酸添加量对NPN、NH3-N、FAA-N、Pep-N含量有显著影响（P<0.05），同一取样时间下，各组NPN、NH3-N、FAA-N含量随单宁酸添加量升高而显著降低（P<0.05），Pep-N含量随单宁酸添加量升高显著升高（P<0.05）。

图1 不同单宁酸添加量下紫花苜蓿青贮氮组分含量的变化Fig.1 Changes of nitrogen components in alfalfa silage with different addition of tannic acid

2.4 不同单宁酸添加量对紫花苜蓿青贮微生物群落的影响

如图2所示，各组在不同发酵阶段，主要由变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）和放线菌门（Actinobacteriota）共同构成，其中变形菌门在各组所有取样时间内相对丰度范围为97.78%~34.20%，相对丰度随取样时间增加而下降，相同处理时间，变形菌门相对丰度随单宁酸添加量升高而上升；厚壁菌门占所有细菌的1.08%~62.70%，相对丰度随取样时间增加而上升，成为厌氧环境下主要优势微生物，相同处理时间下，厚壁菌门相对丰度随单宁酸添加量升高而降低；拟杆菌门和放线菌门的相对丰度均小于2%。

图2 不同单宁酸添加量对紫花苜蓿青贮门水平细菌的影响Fig.2 Effects of different tannins additions on the level of bacteria in alfalfa silage

2.5 不同单宁酸添加量对紫花苜蓿青贮瘤胃体外产气量的影响

由图3可知，随发酵时间延长，各组瘤胃体外产气量逐渐升高。发酵时间为3 h时，各处理组瘤胃体外产气量由高到低依次为TA1>TA2>TA0>TA3，TA1组瘤胃体外产气量显著高于其他处理组（P<0.05）；发酵时间为6、12和24 h时，各处理组瘤胃体外产气量为TA1>TA0>TA2>TA3，且TA0和TA1组瘤胃体外产气量差异不显著（P>0.05），且此时TA0和TA1组瘤胃体外产气量均显著高于TA3组（P<0.05）在发酵时间为48 h时，各处理组瘤胃体外产气量为TA3>TA2>TA1>TA0，且TA3瘤胃体外产气量显著高于TA0、TA1和TA2组（P<0.05）。

图3 不同单宁酸添加量对紫花苜蓿青贮45 d体外产气量的影响Fig.3 Effects of different tannins additions on gas production of alfalfa silage for 45 days

3 讨论

3.1 不同单宁酸添加量对紫花苜蓿青贮营养成分的影响

饲料营养水平是衡量苜蓿青贮发酵品质重要因素。Tabacco等在紫花苜蓿中添加板栗单宁酸进行青贮，添加量分别为0.65、1.3、1.95 g·kg-1（DM），分别青贮20、40、60、80、100和120 d后取样分析，研究表明在紫花苜蓿中添加板栗单宁酸可显著降低DM损失，其中添加量为1.95 g·kg-1时，DM含量增加[9]。Syahniar等利用1.88 g·kg-1（DM）板栗单宁酸添加至木薯叶中进行青贮，结果表明在青贮28 d后，CP含量高于对照组，且处理组较青贮前CP含量无显著变化[10]。Nascimento等利用添加量为0、25、50、75 g·kg-1（DM）浓缩单宁酸对紫花苜蓿进行青贮，试验发现单宁酸对紫花苜蓿NDF和ADF含量无显著影响[11]。赵梦迪等添加浓度为0.2%、0.4%、0.6%低水平缩合单宁酸对野火球进行青贮，结果表明不同浓度单宁酸对青贮的NDF和ADF含量影响不显著[12]。本试验研究发现添加单宁酸可显著降低紫花苜蓿青贮的DM、CP含量损失，对NDF、ADF含量影响不显著，与以上研究结果一致。原因可能是单宁酸抑制苜蓿青贮中霉菌、梭菌等致腐菌产生，降低饲料中营养消耗利用及DM损失，而单宁酸与蛋白质络合，防止粗蛋白质发生降解。

3.2 不同单宁酸添加量对紫花苜蓿青贮pH及有机酸的影响

苜蓿青贮中pH可反映饲料在青贮过程中发酵品质。本试验中，添加单宁酸可显著降低青贮pH，在添加0.4 g·kg-1单宁酸时，pH随青贮时间增加由4.09降低至3.71，显著低于对照组，这与单宁酸添加至象草研究结果一致[13]。有机酸含量和种类是衡量苜蓿青贮发酵品质一项重要指标，其中LA、AA和BA在青贮发酵过程中发挥重要作用，高浓度AA和BA对苜蓿青贮品质产生影响，引起苜蓿青贮变质[14]。本研究中添加单宁酸会显著降低LA、AA含量，与李旭娇研究结果一致[15]。原因可能是单宁酸具有抑制苜蓿青贮中微生物氧化磷酸化作用，影响产生LA和AA的微生物正常代谢活动及其活性，单宁酸添加量越高，抑制微生物生长效果越强。本试验中添加单宁酸，LA含量呈下降趋势，pH显著降低，Adesogan等在豌豆小麦混贮中添加16 g·kg-1（DM）单宁酸进行青贮，青贮发酵112 d后，处理组pH和LA含量均显著低于对照组[16]；杨冬梅等在葛藤中添加浓度为3%、4%单宁酸进行青贮，青贮60 d后，pH、LA含量均随单宁酸浓度升高而降低[17]，以上研究与本试验结果一致。原因可能是单宁酸原料呈酸性，可迅速降低紫花苜蓿青贮pH，添加单宁酸可提升紫花苜蓿青贮发酵品质，改变青贮饲料中LA与发酵品质之间的变化趋势。单宁酸作为微生物抑制剂，抑制乳酸菌生长繁殖。Parente研究表明，pH较低的条件下，高浓度LA会对乳酸菌活性起到抑制作用，影响青贮发酵品质，因此在紫花苜蓿发酵过程中应保持适当LA含量以保持青贮品质[18]。本试验中各处理组在青贮发酵15、30、45和60 d时，样品均呈绿色，质地较好，呈酸香气味，无霉变现象；对照组在青贮发酵60 d时，部分茎叶出现少许霉变。BA对青贮品质产生不利影响，品质优良的苜蓿青贮中，BA含量应小于0.1%[19]。本试验中添加单宁酸处理组均未检测到BA，对照组在发酵60 d检测到少量BA，说明在青贮过程中单宁酸抑制丁酸梭菌繁殖，提高紫花苜蓿青贮发酵品质。

3.3 不同单宁酸添加量对紫花苜蓿青贮氮组分的影响

蛋白质降解导致苜蓿青贮中NPN含量升高，NPN生成影响家畜对氮的利用率，构成NPN的NH3-N、FAA-N、Pep-N等均影响反刍动物对饲料蛋白质的吸收。本试验中，发酵前期NPN生成速度最快，发酵后期生成速度趋于平稳，表示苜蓿青贮的蛋白质降解一般发生在青贮前期。原因可能是因在发酵初期植物蛋白酶活性较高，大量植物蛋白酶将饲料中蛋白质快速降解，当青贮时间增加，饲料中氧气含量减少，植物蛋白酶活性降低，导致蛋白质降解现象减慢[20]。本试验中添加单宁酸可抑制NPN升高，且添加量越高，抑制效果越好，Albrecht等利用浓度分别为0~27 g·kg-1（DM）单宁酸与紫花苜蓿、红三叶草、胡枝子等12种基因型豆科牧草进行青贮，青贮35 d取样分析，研究发现添加单宁酸可显著抑制豆科牧草非蛋白氮生成，与本试验结果一致[2]。可能是由于单宁酸具有结合蛋白质的作用，pH较低时，单宁酸易与蛋白质结合生成络合物，抑制蛋白质降解[21]。大量NH3-N生成影响青贮品质，本试验中，添加单宁酸有效抑制NH3-N产生，添加量越高效果越好，可能是因单宁酸会影响游离氨基酸脱氨基，降低游离氨基酸转化作用，抑制NH3-N产生。Pep-N相较于FAA-N更有利于被反刍动物吸收利用[22]，本试验中，单宁酸可以抑制饲料中FAA-N产生，同时可以有效保护Pep-N，防止Pep-N在青贮过程中被降解，且添加量高的单宁酸对Pep-N保护作用更强，与李旭娇研究结果一致[15]。原因可能是单宁酸可以与Pep-N相结合，避免在青贮过程中产生降解现象，同时制植物蛋白酶降解作用，抑制FAA-N产生。

3.4 不同单宁酸添加量对紫花苜蓿青贮微生物群落的影响

本试验发现，紫花苜蓿青贮中变形菌门和厚壁菌门相对丰度最高，表示这两种菌门在紫花苜蓿青贮过程中具有重要作用，与卢强等研究结果一致[23]。壁菌门包括促进青贮发酵的乳酸菌等，是青贮中优势群落，与变形菌门共同组成苜蓿青贮中主要菌群[24]。随青贮时间延长，厚壁菌门占比逐渐升高[25]。厚壁菌门中主要包括产芽孢、非产芽孢和支原体菌群，多种芽孢杆菌可以降解纤维素、蛋白质和碳水化合物等大分子化合物。本试验中，单宁酸抑制NDF、ADF和CP降解，原因可能是因单宁酸添加量越高，厚壁菌门相对丰度降低。变形菌门是革兰性阴性菌，在青贮过程中易与乳酸菌产生竞争，发酵利用底物淀粉等有机物[26]，本试验中变形菌门含量随单宁酸添加量升高而升高，可能是导致在青贮过程中LA含量降低的原因。因此，将单宁酸作为紫花苜蓿青贮添加剂时应注意控制添加量。

3.5 不同单宁酸添加量对紫花苜蓿青贮瘤胃体外产气量的影响

饲料瘤胃体外产气量可反映营养物质在瘤胃内降解程度，产气量越多，表示瘤胃内发酵活动越强。本试验中，随发酵时间增加，各组青贮瘤胃体外产气量均随之升高，体外发酵3~24 h时，添加0.4、0.6 g·kg-1单宁酸处理组紫花苜蓿青贮瘤胃体外产气量均低于对照组，与王敬尧[27]、Geerkns等[28]结果一致。产生这种现象的原因有两方面：一是高水平单宁酸会改变反刍动物瘤胃内碳水化合物的发酵类型；二是因为单宁酸可影响苜蓿青贮微生物活性，使苜蓿青贮不易被微生物降解。本试验中，当体外发酵24~48 h时，添加0.2、0.4、0.6 g·kg-1单宁酸处理组体外瘤胃产气量均高于对照组。包熙旺等利用单宁含量较高香蕉茎叶体外发酵，探究香蕉茎叶中单宁对瘤胃体外产气量的影响，研究发现体外产气量在发酵初期产气量显著低于对照组，当体外发酵到8~48 h时，产气量迅速增加，与本试验结果一致[29]，表明单宁酸在短时间内影响瘤胃消化吸收速度，但随消化时间增加，单宁酸微生物抑制作用减弱，原因可能是单宁酸在瘤胃发酵后期可被瘤胃微生物降解，导致瘤胃消化率升高，产气量增加。

4 结论

紫花苜蓿青贮中添加单宁酸可有效保持干物质含量，改善青贮发酵品质，显著降低粗蛋白质降解，改变紫花苜蓿青贮微生物群落组成，提高48 h瘤胃体外产气量。添加量为0.4 g·kg-1时，厚壁菌门相对丰度较高，青贮45 d后获得稳定品质。