苏云金芽孢杆菌对黏虫致病力及生长发育的影响

于洪春，王 煜，孙苓芙，庄宝龙，李松媛，张蒙皓，侯月敏

（1.东北农业大学农学院，哈尔滨 150030；2.沂水县农业农村局，山东 沂水 276400）

黏 虫[Mythimna separata(Walker)]，属 鳞 翅目、夜蛾科，为害水稻、玉米、小麦等多种植物[1-2]，具有迁飞能力强、发生范围广、暴食性突出、间歇性爆发、经济损失严重等特点[3-4]，是我国危害较重的粮食作物害虫。黏虫作为突发性和爆发性害虫可造成巨大经济损失，威胁粮食生产安全[5-7]。

目前，杀虫灯和糖醋液诱杀成虫的绿色防控措施[2]等均为辅助防治措施，黏虫防治仍以化学药剂防治为主[8]。由于化学杀虫剂连续使用，黏虫对拟除虫菊酯类等化学杀虫剂已产生较严重抗药性[9]，防效降低。且施药次数和用药量增多，增加防治成本，造成环境污染和食品安全性降低。因此，绿色防控技术成为黏虫防治研究热点。

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）对靶标生物具有杀虫特异性，已应用于鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目等害虫生物防治[10-11]。在利用Bt防治黏虫领域，昆虫病原线虫与Bt联用可提高对黏虫防效[1]，表达Cry1Ab杀虫蛋白的转Bt玉米对黏虫幼虫有较好控制效果[12-13]。对黏虫有杀虫活性的Bt蛋白筛选研究也有报道[14]，但有关Bt菌株对黏虫致病力研究较少。因Bt菌株异质性，不同菌株对同一寄主昆虫致病性存在较大差异，因此，搜集、筛选和分离高致病力菌株是开展Bt防治黏虫应用基础性工作。

本研究在64株Bt菌株对黏虫幼虫杀虫活性前期试验基础上，筛选出活性较高的9株Bt菌株，采用生物测定方法，筛选出高致病力Bt菌株，明确其对黏虫不同虫龄幼虫及成虫致病性和致病力；测定Bt致死中浓度处理的黏虫幼虫、成虫生物学指标，探究其对存活虫体生长发育影响，为开展Bt防治黏虫提供理论和试验证据，对黏虫绿色防控、化学农药减量和食品安全具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫源

试验用虫为哈尔滨市郊区黑光灯诱集的黏虫成虫，带回实验室饲喂5%蜂蜜水后收集卵块，在人工气候箱内用新鲜玉米苗饲养幼虫，根据试验所需选取不同虫龄幼虫及成虫。

1.1.2 供试菌株

试 验 所 用Bt5、Bt7、Bt25、Bt30、Bt45、Bt46、Bt61、Bt66和Bt79共9株菌株，为前期试验筛选的对黏虫有杀虫活性的Bt菌株，均由东北农业大学农学院植物保护系农业昆虫与害虫防治研究室提供。

1.1.3 培养基

LB固体培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，水1 000 mL，5%氢氧化钠调节pH 7.4~7.6。

1.2 方法

1.2.1 高致病力菌株筛选

将预试验筛选出杀虫活性较高的上述9株Bt菌株接种到LB固体斜面培养基，28℃条件下培养48 h后用无菌水洗下制成菌悬液并用血球计数板计数。按10倍稀释法，稀释至1×109、1×108、1×107、1×106和1×105芽孢·mL-15个浓度，采用浸渍法处理新鲜玉米叶片。每处理接入2龄幼虫25头并饲喂带菌叶片，设置清水对照，3次重复。处理后在温度（25±1）℃、相对湿度（75±10）%、光周期L14：D10人工气候箱中饲养。每24 h调查并记录死虫数，重新更换新鲜叶片，连续观察记录至144 h。计算试虫死亡率和校正死亡率，求得各菌株第6天毒力回归方程和LC50，筛选出致病力最高菌株。

1.2.2 Bt菌株对不同虫龄幼虫致病力

将1.2.1筛选出致病力最高Bt菌株于28℃培养48 h后，用无菌水洗下。菌液稀释至1×108、1×107、1×106、1×105和1×104芽孢·mL-15个浓度，浸渍法处理玉米叶片后饲喂1龄幼虫；1×109、1×108、1×107、1×106和1×105芽孢·mL-15个浓度处理玉米叶片后饲喂2龄、3龄幼虫；1×1010、1×109、1×108、1×107和1×106芽孢·mL-15个浓度处理玉米叶片后饲喂4龄幼虫。调查和统计方法同1.2.1，计算求得不同虫龄下菌株毒力回归方程和LC50。

1.2.3 Bt菌株对成虫的致病力

将1.2.1筛选出高毒力Bt菌株配制成1×1010、1×109、1×108、1×107和1×106芽孢·mL-15个浓度菌悬液，然后分别加入蜂蜜制成5%蜂蜜水菌悬液。在每个透明塑料杯（容积300 mL）中接入一对24 h内羽化的雌雄成虫，用脱脂棉浸蘸蜂蜜水菌悬液置于杯底瓶盖上，杯口罩纱布用橡皮筋箍紧，每处理5对成虫，以无菌5%蜂蜜水作对照，3次重复。每24 h调查并记录死虫数，并重新更换新鲜浸蘸无菌5%蜂蜜水的棉花团，连续观察至168 h。计算成虫死亡率和校正死亡率，以及菌株第7天对成虫毒力回归方程和LC50。

1.2.4 Bt菌株致死中浓度处理幼虫对存活黏虫生长发育的影响

根据1.2.2试验结果，筛选出高毒力Bt菌株配制成LC50菌悬液，浸渍法处理玉米嫩叶，以清水作对照，饲喂3龄初幼虫，每24 h记录死虫数并更换新鲜叶片，直至幼虫全部化蛹。记录幼虫发育历期、蛹重、蛹期、羽化率、性比。羽化后成虫随机配对接入塑料杯并在杯底放置浸蘸无菌5%蜂蜜水的棉花团，观察成虫习性，记录成虫寿命及产卵量。随机选取不同处理新产含70~100卵粒的卵块各10块，记录卵期及孵化率，孵化出的幼虫饲养至2龄初，记录1龄幼虫死亡率。

1.2.5 Bt菌株致死中浓度处理成虫对存活黏虫生长发育的影响

根据1.2.3试验结果，配制LC50菌液，以1.2.3方法处理成虫，设无菌5%蜂蜜水作对照，每处理7对成虫，3次重复。每24 h观测成虫死虫数、行为状态及产卵情况，记录每头成虫寿命及产卵量。后代生命力观察和测定指标同1.2.4。

1.2.6 数据处理与分析

采用DPS（V7.05）软件处理分析生物测定数据，计算各处理组毒力回归方程、相关系数和致死中浓度。用T检验分析致死中浓度下处理组与对照组间各项指标差异显著性。死亡率（%）=（处理前活虫数-处理后活虫数）/处理前活虫数×100；校正死亡率（%）=（处理组死亡率-对照组死亡率）/（100-对照组死亡率）×100。

2 结果与分析

2.1 高致病力菌株筛选

9株Bt菌株对黏虫2龄幼虫毒力测定结果见表1。同一浓度下幼虫校正死亡率随时间增加而升高，同一菌株幼虫校正死亡率随菌液浓度升高而增加。各菌株低浓度对幼虫致病力较差，在1×106和1×105芽孢·mL-1处理144 h后校正死亡率不超过17.81%，而在1×109芽孢·mL-1处理144 h后除菌株Bt30、Bt45外，其余菌株校正死亡率均达98.63%以上；Bt46、Bt61和Bt79在次高浓度1×108芽孢·mL-1处理144 h后幼虫校正死亡率达91.78%以上。

表1 9株Bt菌株对黏虫2龄幼虫毒力测定Table 1 Toxicity of nine Bt strains to 2nd instar larvae of Mythimna separata

9株Bt菌株对黏虫2龄幼虫第6天毒力回归方程及致死中浓度（LC50）见表2。菌株Bt30和Bt45的LC50>2.69×1010芽孢·mL-1，对黏虫2龄幼虫致病力较差；Bt46、Bt61和Bt79的LC50小于8.71×106芽孢·mL-1，对黏虫2龄幼虫有较高致病力。其中，菌株Bt46在浓度1×109和1×108芽孢·mL-1处理2龄幼虫24 h后校正死亡率均超81.08%，96 h后两处理组校正死亡率已达100%，杀虫速度快、致病力高，为本研究筛选出的高毒力Bt菌株。

表2 9株Bt菌株对黏虫2龄幼虫第6天毒力回归方程及致死中浓度Table 2 Virulence regression equation and median lethal concentration of nine Bt strains to 2nd instar larvae on the 6th day

2.2 菌株Bt46对黏虫不同虫龄幼虫致病力

菌株Bt46对黏虫不同虫龄幼虫致病力见表3。各处理组幼虫校正死亡率均随时间增加而升高，但菌株Bt46对不同虫龄幼虫致病力存在较大差异。该菌株在试验所设定浓度下处理1龄幼虫致病力均较差，144 h后5个浓度校正死亡率为12.00%~37.33%。Bt46在浓度1×109芽孢·mL-1处理144 h时，2~4龄幼虫校正死亡率分别为100%、92.00%和28.00%；1×108芽孢·mL-1处理144 h时，2~4龄幼虫校正死亡率分别为100%、24.00%和5.33%，低于1×106芽孢·mL-1浓度对幼虫几乎无杀虫活性。相同处理时间下，除1龄幼虫外，校正死亡率均随虫龄增加而降低，当菌液浓度低于某一阈值其致病力骤减。

表3 菌株Bt46对黏虫不同虫龄幼虫致病力Table 3 Pathogenicity of the No.46 Bt strain against larvae of different instars

通过DPS（V7.05）软件分析与计算，Bt46处理1~4龄幼虫144 h后毒力回归方程、相关系数及致死中浓度LC50分别为：Y=0.932X+18.942（R=0.1625），2.09×1018芽孢·mL-1；Y=26.988X-131.38（R=0.9351），5.25×106芽孢·mL-1；Y=18.267X-99.337（R=0.8004），1.51×108芽孢·mL-1；Y=22.267X-150.67（R=0.8386），1.02×109芽孢·mL-1。菌株Bt46对黏虫2龄幼虫致病力最强，其次为3龄、4龄幼虫，而对1龄幼虫致病力最弱。因此确定菌株Bt46防治黏虫幼虫最佳时期为2龄幼虫期。

2.3 菌株Bt46对黏虫成虫致病力

菌株Bt46对黏虫成虫生物测定结果见表4。饲喂成虫菌液后，成虫校正死亡率随时间增加而升高，1×1010芽孢·mL-1处理成虫48~168 h校正死亡率由33.33%升至80.77%。同时校正死亡率随菌液浓度降低而降低，高浓度菌液对成虫致病力较强，当菌液浓度为1×108芽孢·mL-1及以下时成虫校正死亡率低于30.77%，低浓度菌液对成虫致病力较差。Bt46处理成虫第7天毒力回归方程为Y=-0.2950+0.6109X（R=0.9840），致死中浓度（LC50）为4.66×108芽孢·mL-1。观察存活成虫产卵发现，当菌液浓度>1×108芽孢·mL-1时，大部分雌成虫不产卵，产卵时间较未饲喂菌液的对照延后10~48 h，单雌产卵量显著降低，半数以上卵无法孵化幼虫。

表4 菌株Bt46对黏虫成虫的生物测定Table 4 Bioassay of No.46 Bt strain to adults

2.4 菌株Bt46半致死浓度处理幼虫对存活虫体生长发育的影响

菌株Bt46半致死浓度处理黏虫3龄初幼虫后存活群体及其后代各生物学指标见表5。经Bt46处理后，存活幼虫发育历期延长1.1 d、化蛹率降低7.2%、蛹期缩短0.23 d、蛹重增加0.03 g、羽化率降低2.4%、性比（雌：雄）降低0.21%、雄虫寿命延长1.85 d、雌虫寿命延长1.21 d、产卵量减少255粒·雌-1，但与对照组差异均不显著（P>0.05）。处理组后代卵期延长0.40 d，孵化率降低48.20%，与对照组差异显著（P＜0.05）；后代1龄幼虫死亡率达13.82%，为对照组死亡率2倍以上，但与对照组差异不显著（P>0.05）。

表5 菌株Bt46半致死浓度处理3龄幼虫后生物学参数Table 5 Biological parameters of No.46 Bt strain median lethal concentration on 3rd instar larvae and offspring

2.5 菌株Bt46半致死浓度处理成虫对存活虫体生长发育的影响

菌株Bt46半致死浓度处理黏虫成虫后存活群体及其后代的生物学参数见表6。与无饲喂菌液对照相比，处理组雌虫与雄虫平均寿命分别缩短4.76和14.67 d，单雌平均产卵量降低960.8粒，后代1龄幼虫死亡率增加15.68%，与对照组均达极显著差异（P＜0.01）。处理组卵期与对照相比差异不显著。虽然处理组孵化率低于对照组12.10%，但二者差异不显著。饲喂菌株Bt46菌液后，雌虫比雄虫寿命更短，产卵过后即死亡，平均寿命不足4 d，产卵量约为对照组产卵量的1/3。研究结果表明，菌株Bt46半致死浓度饲喂成虫，对成虫及其后代生命力均有不利影响。

表6 菌株Bt46半致死浓度处理成虫后生物学参数Table 6 Biological parameters of No.46 Bt strain median lethal concentration on adults and offspring

3 讨论与结论

苏云金杆菌杀虫活性蛋白不同，其对同种害虫毒力存在较大差异[15-16]。一般认为Bt杀虫晶体蛋白对小地老虎、甘蓝夜蛾、黏虫等夜蛾科害虫不敏感[15]，导致防治效果不理想。本研究在前期选用高浓度对64株Bt菌株初筛基础上，发现9株菌株对黏虫2龄幼虫有较好杀虫活性，从中筛选出毒力最强菌株Bt46，其致死中浓度LC50为5.25×106芽孢·mL-1，在1×108芽孢·mL-1浓度2龄幼虫24 h校正死亡率即达81.08%，96 h达到100%。说明通过扩大Bt菌株筛选范围，可能获得对夜蛾科害虫致病力较强菌株。但浓度低于1×107芽孢·mL-1，菌株Bt46对黏虫杀虫活性急剧降低，其致病力明显依赖于芽孢浓度。

菌株Bt46对黏虫不同虫龄致病力研究中发现，其对黏虫2龄幼虫杀虫活性最高，对3~4龄幼虫杀虫活性明显降低，致病力随虫龄升高而降低，这与沙槎云等认为黏虫幼虫对Bt敏感性随虫龄增加而降低的结论一致[17]。但本研究发现菌株Bt46对黏虫1龄幼虫致病力较差，远低于对4龄幼虫致病力，即使用高浓度菌液，其校正死亡率也未超过40%。原因为黏虫1龄幼虫取食量极低，试验24 h后更换无菌饲料，幼虫取食菌量较少。因此，在生产实践中用苏云金芽孢杆菌制剂防治黏虫适宜虫龄期为2龄幼虫。

本试验将Bt菌株用于黏虫成虫致病性和致病力测定。菌株Bt46在109~1010芽孢·mL-1浓度处理成虫168 h后校正死亡率达53.85%~80.77%，表明其对成虫有致病性和一定致病力，同时未死成虫活跃度降低，部分成虫无法正常飞行，不足半数成虫产卵，产卵时间延后，产卵量少且卵大部分无法孵化。因此，根据黏虫趋化性，在糖醋酒液中添加苏云金芽孢杆菌可有效诱杀黏虫成虫。

近年来，害虫亚致死效应研究渐多，包括对天敌的影响[18-19]及对靶标生物生长繁殖的影响[20-21]。本文研究菌株Bt46半致死浓度对黏虫当代幼虫、成虫及后代1龄幼虫的影响。研究发现，菌株Bt46处理幼虫虽对当代存活幼虫生长发育无明显影响，但当代成虫产卵量降低，后代幼虫孵化率明显降低；处理成虫后，其寿命、产卵量均显著降低，成虫飞行活动异常，后代1龄幼虫行动迟缓，存活率不足80%，表明菌株Bt46半致死浓度对黏虫生长发育产生不利影响，尤其对黏虫繁殖力和后代孵化率、存活率影响较大，与化学农药亚致死浓度处理当代种群导致其繁殖力降低结论一致[22-23]。

本文筛选出对黏虫致病力较强Bt菌株，明确对黏虫不同虫龄和成虫致病力差异，以及半致死剂量对黏虫存活群体生长发育可产生不利影响，研究结果对丰富黏虫绿色防控技术手段，减少化学农药使用量，延缓黏虫产生抗药性和绿色食品生产具有重要意义和实践价值。