重灸对失眠模型大鼠下丘脑Orexin-A表达的影响*

时明伟，蒋西玲，史智君，王孟雨，陈新旺

1.河南中医药大学第三附属医院，河南 郑州 450008；2.南阳市第二人民医院，河南 南阳 473000；3.河南省人民医院，河南 郑州 450008；4.河南中医药大学，河南 郑州 450046

目前，因社会节奏、生活压力等诸多问题，失眠已成为最常见的睡眠障碍之一，影响从儿童到老年各个年龄阶段的人。研究表明，至少33%的成年人出现间歇性失眠症状，10%～22%的成年人有慢性睡眠困难［1-3］。失眠的特点是难以入睡、难以保持睡眠、整晚频繁醒来、醒来无法再入睡、睡眠无法恢复等，常合并有心血管疾病或抑郁、焦虑等情绪障碍。长时间的失眠状态还会导致认知、社交和身体机能的下降，增加工作事故，甚至有自杀倾向［4-5］。因此，失眠的机制研究及适宜干预方法的探讨是临床研究的重点。

睡眠是一个周期性的、节律性的复杂生理过程，由自身生物钟和机体平衡机制严格调控，睡眠/觉醒周期与神经元突触结构和生理变化密切相关，脑内的相关神经递质通过调节神经元活动来控制睡眠与觉醒［6］。研究表明，下丘脑小分子神经肽可能在维持睡眠觉醒的触发开关中具有重要作用［7-8］，参与睡眠-觉醒的调节。Orexin觉醒纤维最重要的作用是维持觉醒，当其功能被抑制时，则觉醒减少，睡眠增加［9］，反之则会维持觉醒状态。艾灸疗法在临床治疗失眠中效果显著，且当艾灸使用量增加时效果尤甚［10-11］。本研究通过采用重灸法来观察下丘脑组织中Orexin-A蛋白表达的变化情况，以阐述重灸在失眠治疗中的作用及对Orexin-A表达的影响，为进一步探讨灸法在治疗失眠中的作用机制提供依据。

1 材料

1.1 动物SPF级雄性SD大鼠40只，体质量（200±10）g，山东鲁抗医药股份有限公司提供，生产批号：SCXK（鲁）-20140007。大鼠饲养于河南中医药大学动物实验中心，自由摄取食物和水，室温22℃，湿度20%～30%，12 h/12 h明暗交替。

1.2 药物与试剂对氯苯丙氨酸（美国Sigma公司，批号：SHBH7873）；兔抗大鼠Orexin-A多克隆抗体、生物素标记山羊抗兔IgG（武汉博士德生物工程有限公司，货号：BA2677-1、BA1005）；即用型SP免疫组化染色试剂盒（北京中杉金桥生物有限公司，货号：SPN-9001）；枸橼酸缓冲液（上海信裕生物科技有限公司，货号：90801A-20）；磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）、TBST缓冲液、PBST缓冲液（上海源叶生物科技有限公司，货号：R20857、R21284、R20863）；精制细艾绒（南阳汉医艾绒厂）。

1.3 仪器清铃揿针（规格：0.3×0.2 mm，固始公元医疗器械有限公司，注册号：豫食药监械（准）字2010第2270165号）；BX53型显微图像采集系统（日本Olympus公司）；DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂）。

2 方法

2.1 分组造模与干预将大鼠按体质量随机分为5组，即空白组、模型组、重灸组、针刺组和温和灸组，每组8只。调节生理盐水的pH至7～8，将对氯苯丙氨酸配置成30 g·L-1的混悬液。除空白组外，其余组大鼠按10 mL·kg-1的剂量腹腔注射对氯苯丙氨酸溶液，每天1次，连续2 d，建立失眠大鼠模型。造模成功后，将大鼠固定在特制鼠笼中，使其不能来回移动，于每天下午14点开始干预。重灸组大鼠背俞穴位置剃毛，涂抹大蒜汁，一次性灸至破溃或化脓后单笼饲养，期间不进行任何处理；针刺组在背俞穴应用揿针治疗，胶带固定，防止揿针脱落，每2天更换一次；温和灸组于背俞穴处进行常规温和灸治疗，每次艾灸10 min，灸至皮肤微微潮红为度，每天1次，连续6 d。空白组、模型组大鼠只固定不做其它处理。背俞穴选取双侧“心俞”“脾俞”“肾俞”穴位，定位参照余曙光主编的上海科学技术出版社《实验针灸学》教材［12］。

2.2 免疫组化测定下丘脑组织中Orexin-A的表达每组取6只大鼠的部分下丘脑组织，固定，切片，片厚4μm，脱蜡，水化，PBS冲洗3次，滴加3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，室温孵育10 min。蒸馏水漂洗2 min，PBS冲洗后抗原修复，放入枸橼酸缓冲液，加热沸腾，反复3次，冷却30 min，PBS冲洗3次。正常山羊血清室温孵育30 min，滴加Orexin-A一抗（1∶100），4℃过夜。室温20 min，PBS冲洗2次，每次2 min，滴加羊抗兔IgG二抗（1∶100），PBS冲洗3次，每次3 min。DAB显色，蒸馏水水洗2次，苏木素轻度复染2 min，中性树胶封片。显微镜观察切片，每张切片随机选取5个不同的视野，用Image-ProPlus 6.0病理图像分析软件，根据染色面积和强度进行半定量分析，结果用光密度（optical density，OD）值表示。

2.3 Western Blot检测Orexin-A的表达各组取6只大鼠的部分下丘脑组织，蛋白裂解、提取、研磨、离心、取上清液，测蛋白浓度后配胶、上样，进行转膜。5%脱脂牛奶封闭1 h，加入稀释后的一抗，4℃过夜。TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，二抗室温孵育1 h；PBST缓冲液洗净二抗，进行化学发光、显影、定影，胶片扫描，应用Gel-proPlus软件计算目的蛋白和内参蛋白β-actin的光密度值，进行数据统计分析。

2.4 统计学方法用SPSS 20.0软件对结果进行统计学处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05表示有显著性差异，P＜0.01表示有极显著性差异。

3 结果

3.1 Orexin-A蛋白免疫组化染色结果与空白组比较，模型组大鼠下丘脑组织中Orexin-A的蛋白表达显著升高（P＜0.05），说明模型制备成功。与模型组比较，重灸组、针刺组、温和灸组大鼠下丘脑组织中Orexin-A的蛋白表达显著降低（P＜0.05）；与重灸组比较，温和灸组与针刺组大鼠下丘脑组织中Orexin-A的蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与针刺组比较，温和灸组大鼠下丘脑组织中Orexin-A的蛋白表达显著升高（P＜0.05）。提示，重灸可明显降低失眠模型大鼠下丘脑组织中Orexin-A的蛋白表达水平。见表1、图1。

表1 各组大鼠下丘脑组织中Orexin-A阳性表达细胞的OD值比较 （±s）

表1 各组大鼠下丘脑组织中Orexin-A阳性表达细胞的OD值比较 （±s）

注：与空白组比较，△P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05；与重灸组比较，▲P＜0.05；与针刺组比较，▽P＜0.05

Orexin-A空白组组别 n 0.12±0.01模型组 6 0.52±0.01△重灸组 6 0.23±0.01*针刺组 6 0.28±0.01*▲温和灸组 6 0.41±0.01*▲▽6

图1 各组大鼠下丘脑组织中Orexin-A阳性细胞表达免疫组化检测图（×200）

3.2 Orexin-A蛋白W estern Blot检测结果与空白组相比，模型组大鼠下丘脑组织中Orexin-A的蛋白表达水平显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，重灸组、针刺组和温和灸组大鼠下丘脑组织中Orexin-A的蛋白表达显著降低（P＜0.05）；与重灸组比较，针刺组和温和灸组大鼠下丘脑组织中Orexin-A的蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与针刺组比较，温和灸组大鼠下丘脑组织中Orexin-A的蛋白表达显著升高（P＜0.05）。提示，重灸可抑制失眠模型大鼠下丘脑组织中Orexin-A蛋白的表达。见图2、图3。

图2 W estern Blot检测各组大鼠下丘脑组织中Orexin-A的表达

图3 Orexin-A蛋白表达的比较

4 讨论

Orexins也被称为食欲素，包含Orexin-A和Orexin-B，位于下丘脑外侧，属于两个孤儿G蛋白偶联受体Orexin-1（OX1R）和Orexin-2（OX2R）的内源性配体，最初被认为是与摄食行为有关，但其主要作为睡眠/觉醒周期的关键调节器，其纤维末梢及受体广泛分布于包括大脑皮层在内的众多脑区［13-14］。Orexins系统与胆碱能、单胺能神经元之间存在广泛的联系，参与多种神经递质的调节，如乙酰胆碱、组胺、去甲肾上腺素、羟色胺和多巴胺等，组成一个控制睡眠-觉醒的复杂网络［15-16］。OX1R在海马区、下丘脑旁核、下丘脑腹内侧核、背缝核、蓝斑等脑区表达；OX2R主要存在大脑皮质、海马、背缝核和许多下丘脑核，包括室旁核和结节乳头体核，而背缝核、蓝斑、结节乳头体核是众所周知的觉醒开始区［17-19］。研究表明，敲除Orexins基因的小鼠、猫均会出现嗜睡症状［20-21］。在蓝斑、背外侧被盖核、脑室或侧脑室注射Orexin则可引起睡眠减少，觉醒增加的情况，这与Orexin-A能够作用于下丘脑多个内稳态中心，增加神经电活动，抑制快动眼睡眠，提高觉醒度有关［22］。

古代医籍中关于“重灸法”记载甚多，《小品方》记载“取穴甚少，灸壮甚多”［23］；《备急千金要方·妇人方》：“妇人胞落颓，灸脐中三百壮”［24］，提出施灸时要注重艾灸的量，施灸时的壮数根据情况可多达几百壮。古人认为，只有灸得发疮，疾病才得以痊愈。《针灸资生经》中云：“凡著艾得灸疮发，所患即差，不得疮发，其病不愈”［25］。古代医家在施灸时都要求灸量充足、得气。《医宗金鉴·刺灸心法要诀》记载：“凡灸诸病，必火足气到始能愈”［26］。“重灸法”是根据古人大病用大剂量艾灸，以及在治病时强调“灸疮必发，去病如把抓”的观点，使得灸治能够达到相应的刺激，更好的调整脏腑功能。现代临床研究发现，针对一些顽固性疾病和慢性病，在进行针灸治疗时，加大灸量达到适合的刺激强度才能发挥灸法的作用［27-28］。不同的灸量对皮下组织影响的差异性、疼痛阈、巨噬细胞吞噬能力、微循环、免疫应答等可产生不同的效果［29-30］。失眠症属于一种慢性病症，长时间不愈会导致全身脏腑的损害，本课题根据重灸法思想，将发灸疮设定为刺激强度，作用于心俞穴、脾俞穴、肾俞穴，起到调心安神、健脾益气、交通心肾等作用，使机体脏腑经络调和通达，气血平和顺畅，机体归于“阴平阳秘”，寤寐有节的状态。本研究结果显示，Orexin-A蛋白在失眠模型大鼠中的表达增加，大鼠保持觉醒的状态；通过重灸、针刺、温和灸的干预后，Orexin-A的表达明显降低，其中以重灸对Orexin-A蛋白表达的影响最为明显，其次是针刺组、温和灸组。提示，重灸对于失眠的干预效果最好。

综上所述，重灸可改善失眠模型大鼠下丘脑Orexin-A的蛋白表达，进而影响大鼠的睡眠，改善睡眠质量。本研究为重灸治疗失眠的作用提供了实验依据，为进一步研究灸法的量效关系提供了借鉴，但重灸治疗失眠的作用机制还有待进一步深入研究。