葛根芩连汤治疗溃疡性结肠炎作用机制研究*

厉越，高凌卉，刘瑶萍，韩昌鹏

1.上海中医药大学附属岳阳临床医学院，上海 200080；2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200080

溃疡性结肠炎是涉及异常免疫反应的肠道慢性炎症，临床可表现为腹泻、腹痛、便血等。其累及部位主要涉及直肠和乙状结肠，严重者可侵及整个结肠。溃疡性结肠炎目前的治疗方案已出现巨大进步，维多珠单抗等药物的出现为溃疡性结肠炎患者带来新的曙光。但目前溃疡性结肠炎治疗存在复发率高，疗效不稳定，价格较高等问题，给个人和社会带来一定负担。

中药治疗溃疡性结肠炎疗效确切，给患者带来新的选择。葛根芩连汤出自张仲景《伤寒论》，由葛根、黄芩、黄连、甘草4味药组成。《方剂学》［1］载葛根芩连汤主治湿热痢疾，表现为便脓血赤白相兼，且腹痛，里急后重较甚，有清热燥湿、调和气血之功，兼能通滞下行，已被广泛应用于治疗腹泻相关疾病，如溃疡性结肠炎等，并取得良好疗效。许爱军［2］使用葛根芩连汤联合柳氮磺吡啶肠溶片治疗溃疡性结肠炎患者48例，结果显示治疗组患者疗效（95.8%）明显高于单纯使用柳氮磺吡啶组（83.3%）。贺佳蓓等［3］分别使用葛根芩连汤和奥沙拉秦治疗溃疡性结肠炎患者共66例，结果表明治疗组（葛根芩连汤组）在有效率和复发率方面均优于对照组（奥沙拉秦组）。越来越多的临床结果证实葛根芩连汤的良好疗效。

葛根芩连汤治疗溃疡性结肠炎使用广泛，临床疗效确切。但目前关于其作用机制的研究较少，且中药治疗疾病由于其多成分、多靶点、多通路的特点，使得很难通过单纯的实验研究证明其作用机制，这给中医药进一步发展带来阻碍。本文使用系统网络药理学方法，通过搜索多个数据库，研究溃疡性结肠炎主要成分葛根、黄芩、黄连、甘草的作用机制，构建葛根芩连汤和溃疡性结肠炎之间的复杂网络，尝试从网络药理学角度探讨葛根芩连汤治疗溃疡性结肠炎的作用机制。

1 资料与方法

1.1 葛根芩连汤有效成分及作用靶点筛选将葛根、黄芩、黄连、甘草输入中药系统药理学数据库和分析 平 台［4］（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），得到每一味中药的成分。通过将筛选条件设定为口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%［5］、类药性（Drug-likeness，DL）≥0.18［6］，进一步筛选有效成分。将得到的有效成分录入Excel文件。继续按照此条件筛选中药有效成分所对应的蛋白靶点，将所得结果录入Excel文件中。在UNIPROT数据库中下载注释文件，匹配靶点蛋白所对应的基因名称，得到葛根芩连汤的靶点基因。

1.2 溃疡性结肠炎疾病靶点基因筛选使用人类基因数据库（Genecards）检索溃疡性结肠炎的基因靶点。Genecards数据库是一个大型的、多元化的整合数据库，提供目前所有已经证实的人类基因的信息。以“ulcerative colitis”为关键词进行检索，将检索结果保存为Excel表格文件。

1.3 构建蛋白-蛋白相互作用网络将葛根芩连汤的靶点和溃疡性结肠炎的靶点进行整合，并去除重复基因和未经证实的基因，得到中药治疗溃疡性结肠炎的潜在作用靶点。将所得结果输入STRING数据库［7］，物种选择“homo sapiens”，得到葛根芩连汤治疗溃疡性结肠炎的靶点蛋白相互作用网络。将所得结果保存为tsv格式文件，使用R语言分析核心靶点，与其他靶点连接次数最多者即为核心靶点。

1.4 构建成分-靶点网络图将葛根芩连汤“成分-靶点”文件及“中药-成分”文件分别导入Cytoscape软件，构建“成分-靶点”网络图及“中药-成分”网络图。

1.5 功能分析使用R语言（3.6.3）中的Cluster-Profiler包［8］进行GO富集分析及KEGG通路分析，并使用EnrichPlot包进行结果可视化。

基因本体论（gene ontology，GO）是对基因在不同维度和不同层次上的描述。对基因的描述一般包括3个层面，即细胞成分（cellular component，CC）、生物学过程（biological process，BP）和分子功能（molecular function，MF）。GO分析和KEGG分析基于超几何分布检验。通过GO富集分析和KEGG分析可得到在某些层面具有显著富集的基因，有助于解释基因的功能。

2 结果

2.1 葛根芩连汤有效成分及靶点葛根共筛选出有效成分4个，黄芩共筛选出有效成分36个，黄连共筛选出有效成分14个，甘草有效成分7个，其中β-谷甾醇为葛根和黄芩共有成分，小檗碱和黄连碱为黄芩和黄连共有成分，槲皮素为黄连和甘草共有成分，共得到57个有效成分。每味中药对应有效成分的详细信息见表1。进一步筛选每个有效成分对应的靶点蛋白，最终葛根共筛选到68个靶点蛋白，黄芩340个靶点蛋白，黄连223个靶点蛋白，甘草178个靶点蛋白。通过与UNIPROT注释文件匹配，并去除重复后，共得到葛根芩连汤靶点基因194个。

表1 葛根芩连汤有效成分

2.2 溃疡性结肠炎靶点以“ulcerative colitis”为关键词搜索GnenCards数据库，共搜索到4 359个靶点基因。去掉相关性低的靶点及未经验证的靶点，以relevence＜4为标准，最终共筛选得到1 273个靶点基因。

2.3 蛋白-蛋白相互作用网络将葛根芩连汤的194个靶点与溃疡性结肠炎的1 273个靶点进行匹配，最终共得到112个共有靶点，结果如图1所示。

图1 疾病靶点和中药靶点韦恩图

将112个靶点导入STRING数据库，得到疾病蛋白-蛋白互作网络。如图2所示。图2中每一个小球表示一个靶点，球中的结构为该蛋白的3D结构。不同颜色的连线表示不同的作用信息来源。紫色表示实验验证，红色表示基因融合，蓝色表示基因共发生，黑色为共表达。从图2中可以发现，不同蛋白之间作用十分复杂，这也在一定程度上说明疾病发生的复杂性及中药治疗的多靶点性。

图2 蛋白-蛋白相互作用网络图

使用R语言（3.6.3）分析核心靶点，结果如图3所示，显示前30个核心靶点。结果表明AKT1以90次的连接次数位于本网络的首位，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGFA）、白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、禽肉瘤病毒17转化基因（v-Jun Avian Sarcoma Virus 17 Oncogene Homolog，JUN）、胱天蛋白酶3（Caspase-3，CASP3）等依次在后，其余核心靶点详见图3。

图3 核心靶点条形图

2.4 成分-靶点网络图构建成分-靶点网络文件，共有37个有效成分和112个靶点。将文件导入Cytoscap软件，得到网络图，如图4所示。图中绿色方块表示成分，橙色圆形表示靶点。葛根有效成分中芒柄花黄素对应28个靶点，其余成分对应靶点较少。黄芩中汉黄芩素对应靶点最多，共有38个，其次是黄芩素，共有29个靶点，并且这2个成分都可作用于关键靶点AKT1（Protein Kinase B，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶），次黄芩素还可作用于IL-6、JUN、CASP3等关键基因，表明其多靶点的治疗作用，且影响关键基因，作用重大。黄芩素也可作用于AKT1、VEGFA、PTSG1等关键基因，也具有强大的调节作用，其余靶点β-谷甾醇、豆甾醇等也具有较多靶点。黄连共检索到有效成分14个，其中槲皮素找到最多靶点，共有123个，这其中包括CASP3、IL-6、JUN、MYC、前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 1，PTGS2）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）等关键基因。

图4 成分-靶点网络图

2.5 功能分析

2.5.1 GO富集分析生物过程（Biological progress）共得到1 909个富集结果，主要包括对脂多糖的反应、对氧化应激的反应、对活性自由氧的反应、对凋亡通路的调节、对转录因子活性的影响、对炎症反应的调节、对细胞分化的反应等。

细胞成分（cellar component）共得到43个富集结果，主要包括转录因子复合体、蛋白激酶复合体、细胞核、NAPDH复合体、细胞膜等。

分子功能（molecur function）共得到123个富集结果，主要包括细胞因子活动、受体配体活动、激酶调节、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）受体超家族、生长因子受体等。

每个GO富集条目取前10条结果以气泡图展示，圆圈的大小表示基因富集的数量，同样颜色由红变蓝表示P值逐渐增大，见图5。

图5 GO富集点图

对于生物过程（BP）的富集结果，将P值由小到大前30个词条的基因富集结果，以点阵图的形式展现（按纵轴从原点起P值由小到大排列），可以直观看出每个生物过程中富集的具体基因，有助于进一步探索发现基因间的相互联系。详见图6。横轴表示基因，纵轴表示BP条目，若基因在BP条目中，则用黑色实心方框表示。

图6 生物过程富集点阵图

2.5.2 KEGG通路分析使用clusterprofiler包进行KEGG通路分析，共富集到150条通路。这些通路大多与炎症相关，例如Inflammatory bowel disease、IL-17信号通路、TNFα信号通路、PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路、NF-κB信号通路等，还有部分通路与肿瘤密切相关，如VEGF信号通路、PD1检查点、P53信号通路等。KEGG通路富集结果展示如图7。图8展示了葛根芩连汤治疗溃疡性结肠炎的靶点在Inflammatory bowel disease通路中的表达情况。结果表明，葛根芩连汤可通过调节NFκB信号通路、T细胞受体信号通路、JAK-STAT信号通路等，发挥对溃疡性结肠炎的治疗作用。

图7 KEGG通路富集结果图

图8 Inflammatory bowel disease通路图

3 讨论

溃疡性结肠炎作为一种自身免疫性的慢性肠道炎症，寻找高效、安全的治疗方法是临床医师的首要任务。溃疡性结肠炎传统治疗方法包括5-氨基水杨酸类药物、类固醇激素类等，但都存在疗效不满意、易复发等问题。中医药治疗溃疡性结肠炎历史悠久，中医古籍中虽没有“溃疡性结肠炎”这一病名，但古代医家治疗“泄泻”“肠风”“下利”等多有心得，为后人留下宝贵的财富。葛根芩连汤为仲景名方，被广泛用于治疗腹泻相关疾病，临床用于治疗溃疡性结肠炎取得良好疗效。葛根芩连汤方中葛根辛甘、凉，可入脾胃经，既能解表，又可调理脾胃，清热止痢，黄芩、黄连苦寒燥湿，黄芩用于上中二焦，黄连用于中下二焦，二者相互配合，增加利湿之功效，甘草和中，制约三药之苦寒。全方共奏清热利湿，解表止痢之功效。

本文通过检索TCMSP数据库，共得到葛根芩连汤有效靶点194个，与溃疡性结肠炎靶点匹配后，共得到葛根芩连汤治疗溃疡性结肠炎靶点112个。AKT1作为本次研究中与其他基因联系最为紧密的基因，已被证实在溃疡性结肠炎患者的肠黏膜中表达明显增高［9］，且在结直肠癌的诊断和预后中具有重要意义［10］。VEGFA也被证实可在多种肿瘤中发挥调节作用［11-13］，并可影响细胞自噬等过程［14］，对炎症也有一定影响。IL-6、IL-10、IL-1B等白细胞介素家族成员广泛出现于炎症调节、细胞自噬、细胞凋亡等研究中，对于各种自身免疫性疾病及肿瘤性疾病都有重要意义。环氧合酶是负责前列腺素合成的限速酶，在某些组织中诸如内皮、肾脏、大脑和肿瘤细胞等中表达，与细胞黏附增加，表型改变，对细胞凋亡的抗性和肿瘤血管生成有关。

GO富集分析结果较多，且主要集中在生物过程条目中。涉及对炎症反应的调节、对氧化应激的反应、对脂多糖的反应、对活性自由氧的反应、氧化供能、细胞膜通透性、多种激酶调节、转录因子调节等。且每个靶点可在不同条目中发挥作用，多个条目之间也可发生相互作用，表明葛根芩连汤治疗溃疡性结肠炎的复杂作用机制，尚需更好的实验方法解决这种多途径同时作用的情况。

KEGG通路分析表明，葛根芩连汤可广泛影响多种经典信号通路发挥对溃疡性结肠炎的治疗作用，例如IL-17信号通路、TNF-α信号通路、PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路、NF-κB信号通路、T细胞受体信号通路、JAK-STAT信号通路等。这些信号通路已有大量实验证实，在此不做赘述。另外，葛根芩连汤还可作用于p53、colorectal cancer等通路，表明其对肿瘤具有一定的调节作用，值得进一步研究。在富集到的Inflammatory bowel disease通路中，有多种经典信号通路共同发挥调节作用，如NF-κB信号通路、JAK-STAT信号通路，以及白细胞介素超家族、T细胞、抗原提呈细胞等。不同作用环节具体发挥的功能也不同，既有促进也有抑制，还存在目前未确定的机制，需进一步研究。且溃疡性结肠炎和克罗恩病在发病机制中存在多种重合，在治疗时也有许多类似的方法，这在一定程度上给研究者和临床医生减轻了负担。

本文利用系统药理学方法探索了治泻名方葛根芩连汤的可能作用靶点及作用机制，结果表明，葛根芩连汤可通过多种靶点、多种生物学过程及通路，对溃疡性结肠炎的发生发展产生作用。从大数据角度说明葛根芩连汤对溃疡性结肠炎治疗的有效性，同时也为进一步研究溃疡性结肠炎提供新的思路，期待中药在治疗此类疾病方面取得更大的进步。