基于网络药理学探讨补阳还五汤治疗强直性脊柱炎的作用机制*

李伟，李春根，穆晓红，陈黎明，赵子义

1.北京中医药大学，北京 100029；2.北京中医医院，北京 100010；3.北京中医药大学东直门医院，北京 100700；4.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）属于主要累及中轴关节的慢性自身免疫性疾病［1］，主要的病理过程是骶髂关节、脊柱及附近肌腱、韧带骨附着点的慢性炎症并继发纤维化、骨化及新骨形成［2］。目前此病的病因、病机尚不明确，考虑与遗传、自身免疫、感染、内分泌紊乱等因素相关［3-4］。流行病学研究发现，我国的发病率为0.3%［5］左右，且男性较女性多发，男女发病比例约为3∶1［6］。目前，尚无此病的根治办法，治疗上主要以控制患者临床症状，延缓病情发展，改善预后为主。西医治疗药物主要有缓解病情抗风湿药（disease-modifying antirheumatic drugs，DMARDs）、非甾体类抗炎药（nonsteroidal antiinflammatory drugs，NASIDs）、糖皮质激素、生物制剂等。非甾体类抗炎药，是治疗强直性脊柱炎的首选药物，可以明显缓解患者疼痛、晨僵等症状，但是不能阻止病情的进展并且长时间使用会导致胃肠道不良反应与肝肾功能损害［7］。缓解病情抗风湿类药，目前临床上主要使用的是氨甲蝶呤、柳氮磺吡啶等，可以有效改善患者病情［8］。但是Zochling等［9］研究发现，目前缺乏明确的证据证明缓解病情抗风湿类药物对于AS患者中轴病变有效。生物制剂以其强大的抗炎及其免疫抑制作用在治疗AS方面具有广大的应用前景，但一旦停用可能导致病情加重而且价格昂贵［10］。中医药治疗AS疾病具有独特的优势。

中医学并无“强直性脊柱炎”病名，多将其归属于“骨痹”“大偻”等范畴。中医学认为本病属于本虚标实之证，肾督空虚为本，感受外邪为标［11］，风寒湿邪留滞筋骨关节，阳气不足，瘀血痰浊内生，脉络瘀阻［12］。治疗当以“标本兼治”为原则。补阳还五汤是《医林改错》的经典方剂，具有补气活血通络之功效，是治疗强直性脊柱炎的常用方剂，均取得了较好的临床疗效。陈倩倩等［13］研究发现，补阳还五汤可以降低AS患者血红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C反应蛋白（C-reactiveprotein，CRP）水平，改善胸廓、脊柱关节活动度及临床症状。相关动物实验表明补阳还五汤能够通过下调小鼠血清Rho激酶活性，抑制ROCK1（recombinant rho associated coiled coil containing protein Kinase 1）、TF（recombinant tissue factor）、MMP-2（matrix metallopeptidase-2）、MMP-9（matrix metallopeptidase-9）等AS相关基因介导的血管平滑肌细胞增殖，最终抑制AS病变的形成与发展［14］。现代药理学研究亦表明，补阳还五汤具有扩张血管，抑制血小板聚集，改善局部微循环等作用［15］。目前，补阳还五汤治疗强直性脊柱炎的主要活性成分及其分子机制未见系统描述。网络药理学是一门新兴学科，是基于分子层面，通过数据可视化分析，构建药物-有效成分-疾病-靶点网络来预测药物治疗疾病的作用机制，弥补了“单成分、单靶点、单药物、单疾病”研究模式的不足。因此，本次研究采用网络药理学方法预测补阳还五汤治疗强直性脊柱炎的有效成分、作用靶点、关键通路，并解释其作用机制。

1 资料与方法

1.1 补阳还五汤药物化学成分及其相关靶点的搜集采用中药系统药理学数据库与分析平台（traditional chinesemedicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）、中药分子机制综合数据库（traditional Chinese medicine integrated database，TCMID）、中药分子机制生物信息学分析工具（a Bioinformatics Analysis Tool for MolecularmechANism of Traditional Chinese Medicine，BATMANTCM），检索补阳还五汤组成药物活性化学成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-like，DL）≥0.18为标准对所有活性成分进行筛选，并搜集有效化学成分相关靶点。

1.2 强直性脊柱炎疾病靶点的搜集通过人类基因数据库（GeneCards）、在线人类孟德尔遗传数据库（onlinemendelian inheritance in man，OMIM）、治疗靶标数据库（therapeutic target database，TTD）、DrugBank数据库，以“Ankylosing spondylitis”为关键词搜集强直性脊柱炎的疾病靶点。删除重复的靶点，导入Uniprot（Universal Protein）数据库进行标准化处理。

1.3 药物-疾病交集靶点、韦恩图及活性成分-作用靶点的构建将补阳还五汤有效成分相关靶点及强直性脊柱炎疾病靶点导入venny 2.1.0在线作图工具，获得药物-疾病交集靶点及其韦恩图并将其交集靶点、有效成分，导入Cytoscape 3.6.1软件，对药物有效成分相关靶点-疾病相关靶点进行映射，构建活性成分-作用靶点网络图。活性成分、作用靶点用“节点”表示，节点之间的相互关系用“边”表示。

1.4 蛋白互作（protein protein interaction，PPI）网络的构建将药物-疾病的交集靶点导入STRING软件中（https：//string-db.org），选择置信度score≥0.400，隐藏游离的节点。下载TSV数据文件，导入Cytoscape 3.6.1软件进行数据可视化分析，使用cytoHubba插件的MCC算法找出PPI网络的核心基因。

1.5 GO生物功能及KEGG信号通路富集分析采用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）数据库（The database for annotation，visualization and integrated discovery）对药物、疾病的交集靶点进行基因本体（gene ontology，GO）生物功能与京都基因和基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信号通路富集分析，设定标准为P值小于0.05，使用imageGP作图软件对pvalue值最小的前20条结果制作气泡图进行可视化分析。

2 结果

2.1 补阳还五汤药物化学成分及其相关靶点通过TCMSP、TCMID、BATMAN-TCM 3个数据库结合相关文献检索，共获得补阳还五汤药物化学成分106个，其中赤芍29个，川芎7个，当归尾2个，地龙3个，红花22个，黄芪20个，桃仁23个；共获取相关靶点1 031个。

2.2 强直性脊柱炎疾病靶点搜索结果通过GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank等数据库并结合相关文献，获得疾病靶点2 148个，其中DrugBank数据库101个，GeneCards数据库1 994个，OMIM数据库50个，TTD数据库3个，删除重复的靶点，最终获得强直性脊柱炎疾病靶点2 093个。

2.3 药物-疾病交集靶点、韦恩图及药物-成分-疾病-靶点网络将补阳还五汤药物成分相关靶点、强直性脊柱炎疾病相关靶点导入venny 2.1.0在线作图工具，共获得雌激素受体-1（estrogen receptor 1，ESR1）、雄激素受体（Androgen Receptor，AR）、RELA蛋白（v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A，RELA）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、基质金属蛋白酶2（matrix metallopeptidase-2，MMP2）等82个交集靶点及韦恩图（见图1）；将药物-疾病交集靶点与药物有效成分相互作用关系及属性文件导入Cytoscape 3.6.1软件并进行映射，构建药物-成分-疾病-靶点网络图（见图2）；根据Cytoscape软件NetworkAnalyzer分析工具算出有效成分degree值，degree值越大表示节点的重要性越大。药物有效成分degree值位于前5位的分别为槲皮素（quercetin）为56，山柰酚（kaempferol）为24，木樨草素（luteolin）为21，黄芩素（baicalein）为14，芒柄花黄素（formononetin）为12。见表1。

图2 补阳还五汤治疗强直性脊柱炎“有效成分-作用靶点”网络图

表1 补阳还五汤药物有效成分及OB、DL值（degree值前10位）

图1 补阳还五汤-强直性脊柱炎交集靶点及韦恩图

2.4 蛋白互作（PPI）网络结果将药物-疾病的82个交集靶点导入STRING软件中，择置信度score≥0.400，下载TSV数据文件，导入Cytoscape 3.6.1软件，共得到82个节点，1 121条边，使用cytoHubba插件的MCC算法找出PPI网络的核心基因，VEGFA、IL-10、基质金属蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP9）、前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）等基因为PPI网络核心基因。见图3、图4。

图3 补阳还五汤治疗强直性脊柱炎作用靶点蛋白互作（PPI）网络图

图4 补阳还五汤治疗强直性脊柱炎前10位核心靶点蛋白互作（PPI）网络图

2.5 补阳还五汤治疗强直性脊柱炎作用靶点GO生物功能富集分析结果采用DAVID数据库对补阳还五汤治疗强直性脊柱炎作用靶点进行GO生物功能富集分析，共获得P＜0.05的GO功能条目366条，其中生物过程（biological process，BP）284条，细胞组分（cellular component，CC）31条，分子功能（molecular function，MF）51条。生物过程主要富集在细胞对脂多糖的反应、RNA聚合酶II启动子转录的正调控、炎症反应、转录的正调控，DNA模板化、对药物的反应等；细胞组分主要富集在细胞外间隙、胞外区、质膜外侧、膜筏、细胞器膜等；分子功能主要富集在酶结合、转录因子结合、细胞因子活性、RNA聚合酶II转录因子活性，配体激活序列特异性DNA结合、类固醇激素受体活性等。见图5、图6、图7。

图5 补阳还五汤治疗强直性脊柱炎作用靶点的BP分析示意图

图6 补阳还五汤治疗强直性脊柱炎作用靶点的CC分析示意图

图7 补阳还五汤治疗强直性脊柱炎作用靶点的MF分析示意图

2.6 补阳还五汤治疗强直性脊柱炎作用靶点KEGG信号通路富集分析结果通过DAVID数据库对补阳还五汤治疗强直性脊柱炎作用靶点进行KEGG信号通路富集分析，删除“cancer”相关通路，共获得P＜0.05的KEGG信号通路87条，根据P值对前30条信号通路绘制气泡图。结合相关文献发现核因子κB（nuclear factor-k-gene binding，NFκB）信号通路、核苷酸寡聚化结构域（nucleotide oligomerzation domain，NOD）样受体信号通路、缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信号通路、细胞因子-细胞因子-受体相互作用等信号通路是补阳还五汤治疗强直性脊柱炎的关键通路。见图8。前10位信号通路富集细节见表2。

表2 补阳还五汤治疗请直性脊柱炎前10位信号通路富集细节表

图8 补阳还五汤治疗强直性脊柱炎作用靶点的KEGG富集分析示意图

3 讨论

强直性脊柱炎的病机为肾督空虚，阳气不足，风寒湿外邪侵袭，留滞筋骨关节，痰浊瘀血内生阻于脉络［11-12］。补阳还五汤是治疗AS的经典方剂，方中黄芪大补元气，气行则血行，瘀去则络通为君药；当归活血而补血，化瘀而不伤正为臣药；桃仁、红花、赤芍、川芎、地龙活血祛瘀，通经活络为佐药，共奏补气活血通络之良效。本次研究，借助网络药理学的研究方法，共获得补阳还五汤药物活性成分106个，通过可视化分析并结合相关文献获悉槲皮素、山柰酚、木樨草素、黄芩素、芒柄花黄素等成分是补阳还五汤治疗强直性脊柱炎的关键药物成分。槲皮素属于黄酮类化合物，相关研究证实槲皮素具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗凋亡、免疫调节等作用［16］。研究发现槲皮素可以抑制人体外周血单核细胞促炎细胞因子TNF-α的增殖及基因水平，降低IL-1β、IL-6等炎症因子以及MMP3、MMP9的表达，抑制炎症介质的产生，从而改善炎症症状［17-18］。动物实验研究发现，槲皮素通过抑制小鼠脊髓小胶质细胞MMP9、MMP2的活化，具有改善疼痛的作用［19］。山柰酚、芒柄花黄素通过下调MMP9、抗酒石酸酸性磷酸酶、整合素β3，抑制破骨细胞骨吸收相关蛋白与基因的表达水平及单核巨噬细胞向破骨细胞的增殖分化，具有骨保护作用［20-21］。此外山柰酚还可以降低FGFR3活性，抑制碱性成纤维细胞因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）对FGFR3-RSK2信号轴的激活水平，调控滑膜细胞的增殖迁移及T细胞介导的炎性细胞因子IL-7、IL-21、TNF-α的释放，缓解炎症反应［20］。研究发现，木樨草素通过调控NF-κB通路和M1巨噬细胞极化，抑制巨噬细胞促炎症细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α的释放而缓解炎症症状［22］；动物研究还发现，木樨草素通过抑制脂多糖介导的NF-κB通路可以减缓细胞凋亡［23］；Kritas等［24］研究证明木樨草素具有抗氧化作用，可以抑制肥大细胞介导的炎症及过敏反应。黄芩素具有抗炎、抗菌、抗氧化、免疫调节、抗癌等作用，黄芩素属于黄嘌呤氧化酶抑制剂，有效抑制黄嘌呤氧化过程中的产生的氧自由基，其具备的羟基结构也赋予了其自由基清除活性［25-26］。张海丽等［27］通过动物实验研究证实，黄芩素可以抑制脂多糖、三磷酸腺苷诱导的巨噬细胞炎症反应。

此外，黄芩素通过调控花生四烯酸代谢通络，抑制环氧煤、脱氧酶、核因子及细胞因子的产生而发挥强大的解热镇痛作用［26］。

通过药物-疾病作用靶点富集分析结合相关文献发现，补阳还五汤治疗强直性脊柱炎关键靶点基因为VEGFA、IL-10、MMP9、PTGS2等。章敏等［28］研究发现VEGF等增殖与迁移，介导了骨与软骨的损伤。IL-10是理想的抗炎因子，Rabelo等［29］研究发现，在接受治疗的AS患者中IL-10呈现高表达水平，代表了抑制性反馈途径及对炎症的抑制反应，Tian等［30］通过动物实验发现IL-10还具有抑制滑膜增殖及促进关节软骨修复作用。MMP9属于蛋白水解酶家族，通过对胶原、蛋白多糖、细胞外基质的降解作用，导致了骨组织及关节软骨的破坏，此外，由于对细胞外介质胶原蛋白的破坏作用，导致细胞屏障的破坏，血管通透性增加和机体炎症反应的发生［31-32］。PTGS2的高表达会导致成纤维细胞样滑膜细胞的增殖，影响血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平，加剧炎症反应［33］。通过对药物-疾病作用靶点的GO生物功能富集分析结果，并查阅相关文献发现细胞对脂多糖的反应、类固醇激素受体活性等生物功能与AS的发生发展密切相关。研究发现，脂多糖具有抗原性，具有刺激机体产生免疫炎症反应，诱导黏附分子、细胞趋化因子、炎症细胞因子在局部关节的聚集，导致机体对自身蛋白聚糖的免疫反应［34］。类固醇激素包括雄激素、雌激素、孕激素等，研究发现类固醇激素通过激活类固醇激素受体启动转录调节，通过神经胶质细胞的作用，为神经元提供营养支持及神经保护［35］。

通过对补阳还五汤治疗强直性脊柱炎的作用靶点，进行KEGG富集分析并结合相关文献发现NF-κB信号通路、NOD样受体信号通路、HIF-1信号通路、细胞因子-细胞因子-受体相互作用等通路是补阳还五汤治疗强直性脊柱炎的关键通路。研究发现，NF-κB信号通路在强直性脊柱炎的发生发展过程中起重要作用，其主要机制是，一方面活化的NF-κB信号通路加速了TNF-α、IL-8、黏附细胞因子等炎症介质的基因表达，加剧了炎症反应；另一方面阻断成纤维滑膜样细胞的凋亡，促进了成纤维滑膜样细胞的增殖［36］。核苷酸结合寡聚域（nucleotide oligomerzation domain，NOD）样 受 体（NOD-like Receptors，NLRs）主要存在于机体免疫细胞及上皮细胞中，在调控机体免疫及炎症反应方面具有重要作用。研究发现，NLR激活后形成高分子复合体，通过受体相互作用蛋白2，进一步激活NF-κB信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPK）信号通路，导致炎症反应的发生；此外，NOD作为细胞内模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR），通过识别细胞壁胞壁酰二肽（muramyl dipeptide，MDP）成分参与机体固有免疫反应，也介导了炎症介质的释放［37-38］。吴洪亮［39］通过动物实验研究发现，HIF-1α通过活化BMP信号通路，促进脂肪干细胞的成骨分化，抑制骨小梁破损，具有良好的骨组织修复作用。相关研究发现细胞因子受体作用蛋白通过活化TNF信号通路、Toll样受体信号通路、驱动细胞坏死、坏死非依赖途径调节炎症小体形成等机制介导了细胞坏死及机体炎症反应的发生［40］。

综上所述，补阳还五汤治疗强直性脊柱炎主要是通过槲皮素、山柰酚、木樨草素、黄芩素、芒柄花黄素等活性成分作用于VEGFA、IL-10、MMP9、PTGS2等靶点基因，从而调节多条生物学功能与信号通路，最终达到治疗作用。但是，此次研究尚存在不足之处，需要后期进一步实验验证。