柔肝化纤颗粒对肝纤维化模型大鼠肝脏炎症因子的影响*

段桂姣，苏晓文，农小欣，符燕青，吕艳杭，王振常

1.广西中医药大学，广西 南宁 530000；2.广西国际壮医医院，广西 南宁 530201

肝纤维化（hepaticfibrosis，HF）是多种慢性损肝因素致慢性肝病的发展过程，以肝内弥漫性细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）过度沉积、肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）激活为特征，具有高发病率及病死率等特点［1］。全世界慢性乙型肝炎患者约有2.4亿人，曾感染过乙肝病毒的约有20亿，每年约有65万人因肝硬化、原发性肝癌及肝衰竭而死亡［2］。流行病学调查发现，我国慢性肝炎患者约3千万人［3］，且广西属于乙肝病毒感染的高发地区及重灾区。药物治疗HF有干扰素或核苷（酸）类药物等，可减轻肝脏损伤程度，阻止肝脏继续受损，防止HF的发生。中医药对防治HF有明显优势，特别是中医复方（如化纤保肝方、鳖甲煎丸、化纤丸、大黄虫丸等［4-7］），可降低HF患者肝脏炎症因子水平及宿主免疫反应等。

研究发现，肝脏受损后，其自身修复可引起HSC活化及肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-TNF，TNF-α）等炎症因子高表达，这是HF的发病基础［8］。中药复方靶向拮抗促炎因子表达对延缓慢性肝炎、HF有重要意义。

柔肝化纤颗粒（壮肝逐瘀煎）是全国老中医林沛湘教授及著名肝病专家关幼波教授在治疗各种慢性肝病的经验基础上总结的。前期课题组研究发现，此方不仅能诱导HSC凋亡，而且对慢性肝炎具有明显改善作用［9］。因此，本研究探讨柔肝化纤颗粒对肝脏炎症因子的影响，为临床通过中药复方抗HF提供依据。

1 材料

1.1 动物SPF级雄性Wistar大鼠120只，6～8周龄，体质量（220±20）g，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2017-0006）。饲养于广西中医药大学第一附属医院医学分子生物学实验室，许可证号：SCXK（桂）2019-0001，分笼饲养并保持实验室温度和相对湿度分别为20～24℃和40%～45%，保持通风光照良好。饲料为标准固体混合无菌饲料，饮水为高压灭菌蒸馏水，饲养期间每天日照12 h。本课题经过广西中医药大学动物伦理委员会批准，伦理批号：20200006。

1.2 药物与试剂柔肝化纤颗粒（江苏天江药业有限公司，组方：黄芪45 g，鳖甲30 g，牡蛎30 g，黄精20 g，枸杞子20 g，薏苡仁45 g，橘红12 g，泽兰30 g，鸡内金15 g，虎杖20 g，大枣15 g。批号：1832792、1807060、1806094、1805013、1812546、1813016、1902096、1806070、1840432、1830561、1806012）；秋水仙碱（西双版纳版纳药业有限责任公司，批号：H53020871）。戊巴比妥钠（上海新亚药业有限公司，批号：H31020240）；体积分数75%乙醇（日照海旭医疗器械有限公司，批号：T34855-2017）；四氯化碳（CCl4）（广州光华化学厂有限公司，批号：20151030）；花生油（益海嘉里食品营销有限公司，批号：SC20145060200180）；40 ng·L-1多聚甲醛（南京试剂厂家，货号：MFCD00003274）；胆固醇（郑州明欣化厂产品有限公司，批号：111618-200301）；苏木精-伊红复染液（北京百奥莱博科技有限公司，货号：GL0658）；TNF-α、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）试剂盒（上海恒远生物科技有限公司，批 号：HY21650E、HY20075E、HY1005E）；TNF-α、TGF-β、IL-6、β-actin（美国Abcam公司，货号：ab183218、ab215715、ab233706、ab8226）；Trizol试剂、逆转录酶、Taq DNA聚合酶、PBS磷酸盐缓冲液（美国Sigma-Aldrich公司，批号：P0016、P0012A、P0018A、P0021）；RNA酶抑制剂（上海恒斐生物科技有限公司，货号：C6101）；荧光定量PCR试剂盒（常州百代生物科技有限公司，货号：BL697A）。

1.3 仪器Fisher Multiskan FC型全自动酶标仪（美国Thermo公司）；7500型实时荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；THUNDER型光学显微镜（德国Leica公司）；80-2B型离心沉淀机（上海化科实验器材有限公司）；Costar型细胞培养板（美国Corning公司）；AEM 480型全自动轮转式石蜡切片机（北京阿莫氏科技开发有限公司）；BSA224S-CW型电子天平（德国Sartorius公司）；1575型洗板机（深圳市科力易翔仪器设备有限公司）。

2 方法

2.1 动物分组与造模将120只Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、秋水仙碱组（0.1 g·kg-1）及柔肝化纤颗粒低剂量组（2.5 g·kg-1）、柔肝化纤颗粒中剂量组（5 g·kg-1）、柔肝化纤颗粒高剂量组（10 g·kg-1），每组20只。除空白组外，其余组大鼠以CCl4复合因素复制HF模型［10-11］。第4周末，每组随机处死1只大鼠，取肝右叶做病理切片，观察大鼠的HF程度，判断大鼠HF模型制备是否成功。模型制备成功后，各组大鼠给予相应的药物进行灌胃，空白组及模型组均给予同体积的生理盐水灌胃，连续给药12周。

2.2 HE染色观察肝脏病理变化每组随机取3只大鼠，麻醉后，开腹取肝右叶，置于40 ng·L-1多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋，切片，脱蜡，脱水，封片后进行苏木精-伊红染色，观察大鼠肝脏的病理改变。

2.3 Western Blot法检测肝脏TNF-α、TGF-β、IL-6蛋白表达 每组随机取3只大鼠，麻醉后，开腹取肝右叶。提取肝脏总蛋白，电泳、转膜、封闭及抗体孵育、曝光。用凝胶图像处理系统分析目标条带的灰度值。

2.4 RT-PCR法检测肝脏TNF-αmRNA、TGF-βmRNA及IL-6 mRNA水平每组随机取3只大鼠，麻醉后，开腹取肝右叶。提取肝脏的总RNA，用微量紫外光度计测定其RNA的浓度及纯度，逆转录为cDNA以备用。以β-actin为内参，检测目的基因的表达量。以2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达量，其中引物序列见表1。

表1 引物序列

2.5 ELISA法检测肝脏TNF-α、TGF-β及IL-6水平将每组剩余的10只大鼠，麻醉后，开腹取肝右叶。将少量肝脏与生理盐水按1∶9稀释后，分别加入生物素标记抗体、过氧化物酶标记亲和素、底物溶液及终止液充分反应后，用酶标仪检测其吸光度值，并按标准曲线计算样品的浓度。

2.6 统计学方法采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，所有数据均用均值±标准差（±s）表示，组间差异比较采用t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠的一般情况空白组大鼠皮毛柔顺紧密光亮，精神状态良好，饮食正常，活泼好动，体质量增加；模型组大鼠皮毛卷曲稀松，无光泽，精神状态差，饮食减少，活动减少，体质量减轻；柔肝化纤颗粒低、中、高剂量组大鼠皮毛光泽柔润，活动较正常，饮食及精神尚可，体质量增加；秋水仙碱组大鼠皮毛光泽度、饮食、活动度、精神状态及体质量均较模型组有改善。

3.2 大鼠肝脏病理损伤变化空白组大鼠肝细胞结构形态正常，无坏死及炎症细胞浸润；模型组大鼠肝脏少数纤维间隔形成，肝细胞形态紊乱，大量炎症细胞浸润在肝小叶周围；柔肝化纤颗粒低、中、高剂量组大鼠肝脏细胞结构、形态趋向正常，浸润在肝小叶的炎症细胞相对较少；秋水仙碱组大鼠肝脏无肝细胞水肿及坏死，炎症细胞浸润少，肝细胞结构、形态相对正常。见图1。

图1 大鼠肝脏病理变化（HE染色，×100）

3.3 柔肝化纤颗粒对HF模型大鼠肝脏TNF-α、TGF-β、IL-6蛋白表达的影响与空白组比较，模型组大鼠肝脏TNF-α、TGF-β、IL-6蛋白表达均显著上调（P＜0.05）；与模型组比较，柔肝化纤颗粒低、中、高剂量组及秋水仙碱组大鼠肝脏TNFα、TGF-β、IL-6蛋白表达显著下调（P＜0.05）。见图2，表2。

表2 柔肝化纤颗粒对HF模型大鼠肝脏TNF-α、TGF-β、IL-6蛋白表达的影响 （±s）

表2 柔肝化纤颗粒对HF模型大鼠肝脏TNF-α、TGF-β、IL-6蛋白表达的影响 （±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05

组别 n 剂量/g·kg-1 TNF-α TGF-β IL-6空白组0.464±0.035 0.531±0.011 0.346±0.053模型组 3 - 1.577±0.318* 1.763±0.325* 1.967±0.178*秋水仙碱组 3 0.1 0.937±0.095＃ 0.993±0.131＃ 0.784±0.157＃柔肝化纤颗粒低剂量组 3 2.5 1.353±0.510＃ 1.317±0.187＃ 1.763±0.325＃柔肝化纤颗粒中剂量组 3 5 1.334±0.325＃ 1.190±0.169＃ 1.097±0.177＃柔肝化纤颗粒高剂量组 3 10 0.634±0.083＃ 0.735±0.046＃ 0.593±0.082 3-＃

图2 各组大鼠炎症因子蛋白表达图

3.4 柔肝化纤颗粒对HF模型大鼠肝脏TNF-α mRNA、TGF-βmRNA及IL-6mRNA水平的影响 与空白组比较，模型组大鼠肝脏TNF-αmRNA、TGF-βmRNA及IL-6 mRNA水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，柔肝化纤颗粒低、中、高剂量组及秋水仙碱组大鼠肝脏TNF-αmRNA、TGF-βmRNA及IL-6 mRNA水平均显著降低（P＜0.05）。见表3。

表3 柔肝化纤颗粒对HF模型大鼠肝脏TNF-αmRNA、TGF-βmRNA及IL-6 mRNA水平的影响（±s）

表3 柔肝化纤颗粒对HF模型大鼠肝脏TNF-αmRNA、TGF-βmRNA及IL-6 mRNA水平的影响（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05

组别 n 剂量/g·kg-1 TNF-αmRNA TGF-βmRNA IL-6 mRNA空白组1.015±0.013 1.003±0.002 1.018±0.012模型组 3 - 1.838±0.272* 2.428±0.140* 1.748±0.150*秋水仙碱组 3 0.1 1.390±0.278＃ 1.655±0.037＃ 1.458±0.130＃柔肝化纤颗粒低剂量组 3 2.5 1.529±0.332＃ 1.958±0.216＃ 1.613±0.557＃柔肝化纤颗粒中剂量组 3 5 1.454±0.250＃ 1.742±0.161＃ 1.308±0.274＃柔肝化纤颗粒高剂量组 3 10 1.289±0.069＃ 1.415±0.232＃ 1.215±0.071 3-＃

3.5 柔肝化纤颗粒对HF模型大鼠肝脏TNF-α、TGF-β、IL-6水平的影响与空白组比较，模型组大鼠肝脏TNF-α、TGF-β、IL-6水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，柔肝化纤颗粒低、中、高剂量组及秋水仙碱组大鼠肝脏TNF-α、TGF-β、IL-6水平显著降低（P＜0.05）。见表4。

表4 柔肝化纤颗粒对HF模型大鼠肝脏TNF-α、TGF-β、IL-6水平的影响 （±s）

表4 柔肝化纤颗粒对HF模型大鼠肝脏TNF-α、TGF-β、IL-6水平的影响 （±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05

组别 n 剂量/g·kg-1 TNF-α（pg·g-1） TGF-β（pg·g-1） IL-6（pg·g-1）10 - 18.56±1.27 48.31±19.81 123.47±5.13模型组 10 - 87.37±9.26* 153.96±41.05* 213.42±16.03*秋水仙碱组 10 0.1 41.43±5.47＃ 121.08±25.77＃ 159.59±9.15＃柔肝化纤颗粒低剂量组 10 2.5 69.64±7.18＃ 142.52±39.35＃ 168.39±12.77＃柔肝化纤颗粒中剂量组 10 5 57.39±6.03＃ 139.72±21.53＃ 175.22±10.64＃柔肝化纤颗粒高剂量组 10 10 32.46±3.81＃ 107.47±21.35＃ 135.72±7.84空白组＃

4 讨论

中医学根据HF的临床表现，将其归属为“胁痛”“黄疸”“肝着”“积聚”等范畴，这与现代医学中HF不同阶段的病理特征基本吻合。中医学认为，HF的病位在肝，与脾、胃、肾、胆密切相关。HF发生的病因病机十分复杂，多因外感毒邪、痰瘀阻滞肝络、湿热蕴结等所致［12-15］，加之饮食不节、饥饱无常、过度劳倦、正气不足，致脾胃受损，土侮木，而伤及肝，出现肝失条达、气郁化火、痰瘀及热毒蕴结等。因此，临床常以活血化瘀、扶正补虚、疏肝解郁健脾、清热渗湿等法进行治疗。肝藏血，主疏泄，当肝失疏泄，肝气郁结会影响血液的归藏和运行，即肝郁气滞、气机不畅，导致血液瘀滞肝络，为HF的“瘀血”论奠定了基础。瘀血参与HF的始终，既是HF的致病因素，又是其重要的病理产物。著名肝病医家周培郁认为，肝病的辨证论治重在“血瘀”；林沛湘教授认为，HF的主要病机为“肝虚血瘀”，可见HF的形成与血瘀密切相关。活血化瘀类中药在防治慢性肝脏损伤、慢性肝炎、HF等疾病具有重要临床意义。

前期临床研究发现，柔肝化纤颗粒能从多层面抑制乙肝病毒复制及传播，显著改善慢性肝炎的临床症状，延缓HF［16-18］。该方由黄芪、鳖甲、牡蛎、黄精、枸杞子、薏苡仁、橘红、泽兰、鸡内金、虎杖、大枣组成。方中黄芪［19］、鳖甲［20］、虎杖［21］、灵芝［22］、当归［23］、绞股蓝［24］、三七［25］、黄精［26］等均可抑制HSC活化、促进ECM降解、抑制肝脏炎症反应等，从而抑制HF的发生。

HF是一个动态且可逆的过程。临床研究认为，HF形成的中心环节是HSC由静止型转化为激活型。在正常情况下，HSC处于静止状态，当肝脏受到损伤时，肝内的HSC会被激活；当肝脏出现活动性炎症时，会促进肝细胞过度分泌TGF-β、IL-6和TNF-α等炎症介质，肝细胞毒性增加，肝脏损伤程度也增加［27］。因此，抑制HSC的活化及减轻肝脏炎症反应在抗HF方面具有重要意义。临床研究发现，慢性肝脏损伤经久不愈会导致HF发生率增加，而炎性因子的异常分泌与HF的形成密切相关［28］。促炎因子IL-6、TNF-α及TGF-β会激活HSC，导致HF发生；同时活化的HSC又能分泌多种趋化因子，促进HF炎症微环境的形成［29-30］。

本实验结果显示，与模型组比较，柔肝化纤颗粒低、中、高剂量组及秋水仙碱组大鼠肝脏TNF-α、TGF-β、IL-6蛋白表达显著下调，肝脏TNF-α mRNA、TGF-βmRNA及IL-6 mRNA水平均显著降低，肝脏TNF-α、TGF-β、IL-6水平显著降低，肝脏病理损伤有所改善。由于HF的病因病机十分复杂，而柔肝化纤颗粒能否通过多靶点调控肝脏炎症因子表达，仍需进一步的研究。