高效液相色谱法测定小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法研究

◎ 刘 霞

（六安市食品药品检验中心，安徽 六安 237000）

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）又称为呕吐毒素，是镰刀菌的次要的生产代谢的产出物，性质十分稳定，且具有一定的耐热、耐压及耐弱酸和耐储藏的特点，所以在普通的食品加工过程中，一般情况下无法破坏其本身结构，如果对其加入碱或者是进行一些特殊的高压步骤，则会破坏其中的一些毒素。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇是粮食检测中十分重要的安全指标，是粮食中十分危险的自然污染物之一[1]，分布特别广泛，因此小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的存在不可避免，当人们误食了含有DON的食物时，往往会出现厌食、呕吐、腹泻等中毒症状，有情况严重者甚至可能会死亡。由于其具有一定的危害性，对此各个国家都制定了一系列严格的限量标准。比如加拿大规定，牛和鸡的饲料中DON含量不能超过5 mg·kg-1，在猪和小牛的饲料当中不能超过1 mg·kg-1；澳大利亚规定了黑麦当中的DON含量不可超过0.5 mg·kg-1；我国规定了谷物当中的DON含量不能超过1.0 mg·kg-1。

伴随着人们食品安全意识的提高，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的相关检测工作也得到了重视，因此脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测方法的相关报道也在不断增加。常用的检测方式有4种，包括同位素稀释液相色谐-串联质谱法、免疫亲和层析净化高效液相色谱法、薄层色谱测定法、酶联免疫吸附筛查法。目前，免疫亲和层析净化高效液相色谱法是一种最为有效也最能准确定量的检测方法，通过免疫性亲和柱可以把脱氧雪腐镰刀菌烯醇更好地从谷物和相关制品中进行有效分离，净化效果明显。但是此方法种前处理的相关研究报道十分稀少，本次实验选择了适用于多种类别食品检测的免疫亲和层析净化-高效液相色谱法，研究了小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定的线性范围及回收率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市售小麦粉；脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品；脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫亲和柱；色谱纯甲醇、乙腈。

1.2 仪器与设备

岛津LC-20A高效液相色谱仪；紫外检测器；台式高速离心机；超声波清洗仪；固相萃取装置；氮吹仪

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

称取小麦粉25 g置于100 mL离心管中，加入5 g聚乙二醇，加水100 mL，混合均匀，置于超声波清洗仪中超声20 min，后放入离心机，10 000 r·min-1离心10 min，收集上清液。取上清液2 mL过脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫亲和柱，然后使用磷酸盐缓冲溶液和水进行淋洗，加入2.0 mL甲醇洗脱，收集全部洗脱液，50 ℃下氮气吹至近干，加入1.0 mL初始流动相，溶解残渣，涡旋混匀，过滤膜，待测[2]。

1.3.2 色谱条件

色 谱 柱：Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇∶水=20∶80；紫外检测器：检测波长218 nm；流速1.0 mL·min-1；柱温35 ℃。

1.3.3 回收率的测定

称取6组空白样品，分别加入不同含量的脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品，按照1.3.1的方法进行前处理操作，采用免疫亲和层析净化-高效液相色谱法对样品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量进行测定，计算加标回收率。

2 结果分析

2.1 标准曲线的绘制

经液相色谱紫外检测器测定，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的保留时间为 9.312 min，在 0.1 ～ 5.0 µg·mL-1浓度范围内线性关系较好，线性方程为：y=76 368.1x+1 286.80，相关系数R=0.999 9。脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液的色谱图见图1，标准曲线见图2。

图1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液的色谱图

图2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的标准曲线图

2.2 免疫亲和层析净化法的加标回收率

采用免疫亲和柱进行净化，按照前述处理方法及仪器测定条件，测定不同加标量的回收率，加标样品的色谱图及回收率测定结果分别见图3和表1。

图3 加标样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的色谱图

表1 不同加标量的回收率表

3 结论

本文采用免疫亲和层析净化高效液相色谱法，对小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量进行了测定。实验结果表明，脱氧雪腐镰刀菌烯醇在0.1～5.0 µg·mL-1浓度范围内线性关系较好。而回收率在不同添加浓度上存在一定差别，可能是提取液在免疫亲和柱上的流速不同导致的[3]。

免疫亲和柱的作用原理是根据抗原抗体的特异性进行结合[4]，在柱体中加入可以与特异性抗体相结合的凝胶物质，将待测物吸附出来。待测提取液需缓缓均匀地经过净化柱，在提取液完全经过柱体后，再对该柱体进行抽干，最后加入洗脱液进行淋洗洗脱。在此过程中，若提取液在柱体表面流动过快，免疫亲和柱中的特异性抗体就不能及时和脱氧雪腐镰刀菌烯醇相结合，被吸附的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的数量比实际数量少，实验的结果就会偏低。本次实验对小麦粉进行了相应的研究，但是相比于其他食品，如大米，食用性植物油等产品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇[5]含量的检测仍需进一步研究才能确定。

对于检测数量稀少的样品，需要通过均质法进行样品前处理，这样能够达到快速和准确检测的效果。对大批量样品的检测工作而言，通过振荡提取的方式不仅能够保证实验的准确性，也节省了实验的时间成本。同时，样品的细度对于样品检测的结果影响也很大，在样品经过了研磨以后，筛子的孔径过小或是过大，都会导致目标物提取不充分。因此，应当选择恰当的筛子孔径。