骨碎补总黄酮基于Notch信号通路改善骨质疏松的作用及机制

黄翔宇 林立垚 郝敏 刘凯

(1丽水学院，浙江 丽水 323000；2丽水市第二人民医院)

骨质疏松常表现为原发性类型，其特征为骨量减少、骨强度下降等骨组织显微结构变化，致使患者骨脆性增加，进而引发骨折等临床表现〔1〕。骨质疏松患者最常表现为腰背部的疼痛，进而可致全身骨骼疼痛或髋、膝及腕关节，对患者的生活质量产生严重影响〔2，3〕。骨碎补作为中医骨科常用的中药品种之一，具有活血续伤、补肾强骨的功效，且现代药理研究表明，其主要成分总黄酮(DMF)能够有效作用于骨质疏松患者，可维持其骨微结构的完整程度，并提升骨密度〔4〕。现阶段关于DMF对于骨质疏松患者的作用机制尚不明确，可能作用于Notch信号通路中，进而产生相应的连锁反应。本文旨在研究DMF对于骨质疏松的作用效果及机制。

1 材料与方法

1.1试剂 胎牛血清(以色列Biological Industries公司)、DMEM高糖培养液、DMEM/F12培养液、磷酸盐缓冲液(PBS)(美国Hyclone)、Ⅰ型胶原酶(美国Invitrogen公司)、红细胞裂解液(中国Solarbio公司)、Notch-1一抗、Hes-1一抗、GAPDH一抗(美国Cell Signaling Technology公司)、Trizol试剂盒、逆转录试剂盒、聚合酶链反应(PCR)扩增试剂盒(日本TaKaRa Bio公司)、肿瘤坏死因子(TNF)-α试剂盒、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1试剂盒、白细胞介素(IL)-6试剂盒(上海中乔新舟公司)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天公司)及水合氯醛(成都科龙化工公司)。

1.2仪器 高速冷冻离心机(上海安亭公司，型号TGL-16G-A)、实时荧光定量PCR仪(美国Applied Bio公司，型号7300)、电子天平(上海特勒托多利多公司，型号EL204)、酶标仪(德国Thermo公司)、电泳仪(美国Beckman Coulter公司)、凝胶成像仪(美国Bio Rad提供)。

1.3药品 强骨胶囊(北京岐黄医药股份有限公司，国药准字Z20030007，主要成分为DMF，规格0.25 g/s)。

1.4实验动物 SD大鼠63只，雌性，均正常发育，6～8月龄，体重160～200 g。

1.5方法

1.5.1制备含药血清 大鼠均予以强骨胶囊进行灌胃，剂量为1 800 mg/kg，每日2次，持续3 d，后参照文献〔5〕进行含药血清制备。研究共分为7组是体外实验研究，分离培养大鼠骨髓基质细胞，以不同配比给药方式探讨总黄酮改善骨质疏松是否与Noch信号通路有关。

1.5.2分离并鉴定骨髓基质细胞 将1月龄的大鼠胫骨与股骨取出，并参照文献〔6〕分离并鉴定其骨髓基质细胞。

1.5.3RT-PCR检测Notch-1、Hes-1 mRNA水平〔7〕以维A酸(RA)诱导建立大鼠骨质疏松模型，并取1.5.2对数生长期大鼠骨髓基质细胞，将其接种至6孔板内，接种浓度为5×103/ml，并对每组大鼠设置复孔，复孔数目为3个；以10%胎牛血清的DMEM培养基于培养箱中进行培养，设置培养箱环境为37℃，并含5%CO2，贴壁培养24 h；NC组骨髓基质细胞予以含10胎牛血清的DEME高糖完全培养液进行培养；RA组骨髓基质细胞予以浓度为0.4 mmol/L的RA进行培养；DMF联合RA组骨髓基质细胞予以含DMF血清的DEME高糖完全培养液及浓度为0.4 mmol/L的RA进行培养；Jagged Ⅰ蛋白联合RA组骨髓基质细胞予以浓度为1 000 μg/L的Jagged Ⅰ及浓度为0.4 mmol/L的RA进行培养；Jagged Ⅰ蛋白联合DMF及RA组骨髓基质细胞予以浓度为1 000 μg/L的Jagged Ⅰ、含DMF血清的DEME高糖完全培养液及浓度为0.4 mmol/L的RA进行培养；γ-分泌酶抑制剂(DAPT)联合RA组骨髓基质细胞予以浓度为16 μmol/L的DAPT及浓度为0.4 mmol/L的RA进行培养；DAPT联合DMF及RA组骨髓基质细胞予以浓度为16 μmol/L的DAPT、含DMF血清的DEME高糖完全培养液及浓度为0.4 mmol/L的RA进行培养；以Trizol试剂盒对以上各组骨髓基质细胞总DNA予以提取，以核酸测定仪对各组RNA纯度及浓度予以测定；各组均取1 μg骨髓基质细胞进行逆转录，生成cDNA，以SYBR green染料法对其进行定量检测，并对其进行扩增〔8，9〕，Notch-1：正向引物5′-CTCCCCGTTCCAGCAGTCTC-3′，反向引物5′-CAGCCACTCGCATTGACCAT-3′；Hes-1：正向引物5′-AGGCGGCTAAGGTGTTGGAGG-3′，反向引物5′-GGCCGCTGGAAGGTGACACTG-3′；GAPDH：正向引物5′ACCCATCACCATCTTCCAGGAG-3′，反向引物5′-GAAGGGGCGGAGATGATGAC-3′。

1.5.4Western印迹检测Notch-1、Hes-1水平〔10〕按1.5.1细胞培养及给药方法进行制备，提取细胞内的组织总蛋白，BCA法测定蛋白质含量，并进行凝胶电泳，进样量为20 μg，将其电转至聚偏氟乙烯膜上，以3%脱脂奶将其封闭2 h，于4℃下孵育Notch-1及Hes-1一抗与GAPDH一抗过夜，以TBST洗膜，且在二抗孵育后明显显影；以Quantityone软件分析条带亮度。

1.5.5免疫组化法检测Notch-1、Hes-1水平〔11〕以常规法制备5 μm石蜡切片，并对其进行免疫组化染色，以浓度为10 mmol/L的柠檬酸盐缓冲液对其进行热激，时长30 min，刺激其抗原复性，于4℃下孵育Notch-1及Hes-1一抗与GAPDH一抗过夜，以TBST洗膜，孵育二抗后向其中加入显色液予以曝光，结合其染色强度进行评分。

1.6统计学方法 采用SPSS22.0软件进行t检验及χ2检验。

2 结 果

Jagged Ⅰ联合RA组Notch-1、Hes-1 mRNA、蛋白水平显著高于RA组(P<0.05)，DMF联合RA组及DAPT联合RA组Notch-1、Hes-1 mRNA、蛋白水平显著低于RA组(P<0.05)；Jagged Ⅰ联合DMF及RA组Notch-1、Hes-1 mRNA、蛋白水平显著低于JaggedⅠ联合RA组(P<0.05)；DAPT联合DMF及RA组Notch-1、Hes-1 mRNA、蛋白水平显著低于DAPT联合RA组(P<0.05)，见表1。

表1 各组骨髓基质细胞Notch-1、Hes-1 mRNA、蛋白水平

3 讨 论

骨质疏松作为老年患者常见的骨科疾病，其本质为患者骨密度与骨质量的下降所致骨微结构受损，徒增其骨脆性，进而具有较高概率引发全身性骨病〔12〕。现阶段临床上通常将骨质疏松分为两类，即继发性与原发性，而原发性骨质疏松是目前常见的类型，多出现于老年患者。骨质疏松具有高发病率，对于患者的日常生命活动具有极大影响。而相关研究表明，Notch信号通路对于疾病的发生及发展具有直接关联，可调控细胞的多种进程〔13〕。Notch具有多种受体，常见的为Notch-1、Notch-2、Notch-3及Notch-4，当受体与配体进行特异性结合后，Notch信号通路则因此被激活，并向其激活下游靶基因Hes进行转录。其中Hes-1作为Notch信号通路下常见的Hes基因，同样因转录而被激活〔14〕。现阶段，与Notch信号通路相关的各信号分子、受体及下游靶基因Hes等在骨质疏松患者中的表达机制尚不明确。研究表明，DMF能够促进新骨形成，同时抑制骨的吸收，增加患者的骨密度，且DMF作为中药材骨碎补的有效成分，现代药理研究发现，DMF能够有效针对化学刺激及热传导所引发的拟痛反应，且具有明显的量效相关性〔15〕。本研究结果说明DMF对于骨质疏松具有明显的改善效果，且其作用机制大致与Notch信号通路相关。