芳香烃受体与慢性肾病发生发展关系的研究进展

刘奕耘，杨广磊，朱芮弘，马永超，谢群慧，赵 斌

(中国科学院大学，北京 100049；中国科学院生态环境研究中心，北京 100085)

慢性肾病(chronic kidney disease，CKD)是世界性的公共卫生问题，其发病率持续增长。尿毒症是CKD发展的最后一个阶段，患者血液中会积累大量的蛋白结合尿毒素(protein binding urotoxin，PBUTs)，如硫酸对甲酚(para-cresol sulphate，PCS)、吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)、硫酸吲哚酚(indophenol sulfate，IS)等，这些物质的蓄积可引起肾内外细胞氧化应激、炎症、纤维化和凋亡，从而促进CKD向终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)发展。在病理过程方面，肾间质成纤维细胞的活化、肾小球硬化、以及肾动脉硬化被认为是在CKD发生发展中组织损伤的共同病理基础。在病因方面，除急性肾损伤、高血压、糖尿病等是已知的可能促进CKD的因素以外，尚有病因不明CKD患者；同时，有学者认为环境因素也可能参与CKD的发生发展。2015年，Kataria等[1]综述了有机化合物暴露与肾脏健康的关系，指出有机污染物如邻苯二甲酸酯、双酚A、二恶英和呋喃、多氟烷基酸、多环芳烃和多氯联苯(polychlorinated biphenyls，PCBs)等的暴露会影响肾小球滤过率和血清尿酸浓度，并可导致持续性肾损伤。

芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AhR)是一种配体激活的转录因子，是介导PBUTs和环境污染物生理毒理作用的重要受体，在胚胎发育过程中以及成年生物体的组织中广泛存在。AhR不仅在肾脏的多种细胞中都有表达，Harrill等[2]还发现AhR基因敲除大鼠的尿液颜色、细胞组分、肾脏组织结构均发生了改变，说明AhR基因的正常表达在肾脏及泌尿系统中发挥重要的生理功能。此外，AhR被内源或外源配体激活后，可以调控其下游一系列基因表达，调节机体内重要的代谢酶P450酶家族的活性；或与其他信号通路相互作用，进而调控细胞损伤过程。这些AhR信号通路介导的代谢、氧化应激与炎症调节也同样存在于肾脏的组织中。由此可见，AhR信号通路活性的调节不仅在肾脏内环境稳态的维持中发挥重要作用，还参与到肾脏对多种内外源化合物产生生物响应的过程；并可能对响应的结局是趋向于代偿性防御，或是对毒性损伤产生重要影响。通过系统总结AhR信号通路与CKD病理过程的关系，不仅有助于建立多种AhR活性物质对肾脏的生理、毒性与健康效应的评价方法，也为进一步探寻AhR及其信号通路参与CKD的发生发展过程的直接和间接证据提出方向。

因此，本文从AhR介导的肾脏损伤和血管损伤总结了AhR表达与活化对CKD进程的影响，希望借此加深对AhR发挥生物效应的认识，同时为开展环境化合物与肾脏健康关系的研究提供思路。另外，由于多种有肾保护作用的天然化合物具有AhR活性，我们还对这些特征化合物进行了探讨，并评估了AhR作为CKD干预手段研究靶点的潜力。

1 AhR介导肾脏细胞的损伤

大量实验证明，急性肾损伤可导致肾脏生理结构和功能发生改变，比如肾小管形态变化、肾小管间质纤维化、肾小管周微血管网密度降低，化合物诱发的肾脏炎症、氧化应激反应等肾脏损伤均能引发CKD。

病理学研究显示，暴露于2,3,7,8-四氯二苯并-对-二恶英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)和PCBs均可引起肾脏病理学改变，如间质炎症、近端和远端曲小管扩张、肾小球炎症及纤维化等。此外二者联合暴露可导致更明显的肾组织肿胀、细胞质空泡化、近端肾小管上皮细胞坏死[3]。人们普遍认为TCDD和类二恶英PCBs同系物的毒性作用主要由AhR所介导，TCDD与AhR的相互作用以及CYP1A亚家族的激活对活性氧(reactive oxygen species，ROS)的形成和毒性作用做出了显著贡献。Lu等[4]观察到CYP1A1在肾脏中的表达在所有TCDD处理组中均显著上升，并且联合接触PCBs和TCDD后表达更加显著，因此猜测TCDD的肾脏毒性作用是由AhR介导的。同样，作为芳香烃类物质，AhR的内源性配体IS可延长AhR的激活状态，在这期间肾透析患者的毒性效应更为明显。从而说明AhR在CKD发生发展过程中具有关键的作用，可能是多种肾脏损伤的作用靶点。目前，普遍认为肾纤维化是多种原因引起的CKD进展至终末期肾病的共同病理特征，包括肾小球硬化、肾小管间质纤维化和血管硬化[5]。

1.1 AhR介导肾小管损害肾单位是完成肾基本功能的主要结构，包括肾小球和肾小管两部分。其中肾小球主要起滤过功能，肾小管则承担重吸收和分泌功能。由于肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cells，GMCs)和肾小管上皮细胞对芳香烃类化合物表现出不同的细胞毒性反应谱[4]，证明该类化合物对肾小球和肾小管的影响并不相同，因此我们将区分AhR在不用组织中介导的生物学效应。

近端肾小管因为具有运输和积累外源性化合物及其代谢产物的能力，成为肾毒性化合物的常见靶点。Sun等[6]通过在人近端肾小管上皮细胞HK-2和小鼠模型上实验发现，暴露于IS或PCS可导致肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)标志蛋白和促纤维化因子转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)表达量升高。用RAS靶向药物氯沙坦处理后，肾脏纤维化程度和TGF-β1表达水平降低。Ng等[7]发现IS经阴离子转运蛋白3(anion transporter 3，OAT3)的摄取在HK-2细胞中大量累积，并通过AhR/STAT3途径使Mas受体在大鼠肝脏和HK-2细胞中的含量降低，且在HK-2细胞中其降低量与IS浓度呈时间-剂量依赖性。使用尿毒症治疗药物AST-120或用AhR和STAT3的干扰RNA抑制相关基因表达后，可抑制Mas受体的降低。Mas受体是RAS的重要组成部分，通过与血管紧张素-(1-7)(angiotensin -(1-7)，Ang-(1-7))结合促进血管扩张、抑制细胞增殖，减少纤维化和炎症等反应，抗衡血管紧张素II(angiotensin II，Ang II)与其受体AT1结合产生的氧化应激、血管收缩、细胞增殖、尿钠潴留等，对于生物体内正常稳态的维持和损伤修复具有重要作用[8]。以上实验表明AhR可通过介导Mas受体的降低，打破RAS的平衡进而对肾小管产生损害。

肾小管纤维化是肾小管损伤的一种表现，可由多种因素造成，比如炎症、氧化应激等。一氧化氮是重要的炎症介质，一氧化氮合酶分为3个亚型：内皮型NOS(endothelial NOS，eNOS)、神经元型NOS(neuronal NOS，nNOS)和诱导性NOS(inducible NOS，iNOS)。nNOS和iNOS可加重炎症反应，与之相反，eNOS可抑制细胞衰老，并降低氧化应激，其含量的增加在下调肾纤维化方面具有显著的作用，但是eNOS的减少可能会加速肾小球和肾小管间质的损伤，改变肾小管微循环的动态，加重肾缺血微环境[9]。Ng等[7]研究发现，IS可导致eNOS发生磷酸化，从而失去活性。敲除STAT3、AhR和OAT3基因可抑制IS引起的eNOS磷酸化。因此eNOS的磷酸化可能是肾脏发生氧化应激、细胞衰老从而产生肾毒性的原因，加速了CKD的进程。

上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)现象在胚胎发育、创伤愈合、组织再生、器官纤维化和癌症进展中起着关键作用。小鼠肾脏纤维化的过程中，大约12%的成纤维细胞来源于骨髓，约30%是肾小管上皮细胞通过EMT作用转化而来，此外约有35%是肾脏的微血管系统通过内皮-间质转分化而来[10]。虽然没有直接的研究证据表明，在肾脏中AhR与EMT的过程相关，但通过对其余组织和多种生物体的研究发现，AhR介导内外源配体对肝、肺等细胞的EMT过程。例如，AhR的激活可诱导小鼠肝脏细胞纤维化，同时使上皮标志物紧密连接蛋白(Claudin-1)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达水平下降。当AhR基因敲除后，上述现象消失，证明EMT依赖于AhR的转录[11]。AhR的内源性配体犬尿氨酸可以通过AhR促进人肺癌细胞95D的迁移和EMT标志物波形蛋白增加，抑制上皮蛋白如E-cadherin的下调[12]。因此我们猜测在人类的肾脏中，TCDD、PCBs、IS等AhR内外源配体也有可能通过AhR诱发EMT，促进肾间质纤维化，进而加快CKD进程。

1.2 AhR介导肾小球损害肾小球滤过率是反映肾小球滤过功能的直接、客观的指标，是CKD患者分期的主要依据。肾毛细血管中的肾小球内皮细胞是参与肾小球滤过功能的第一屏障，即机械屏障-滤孔，也是参与肾小球选择性滤过的重要成员。如上所述，AhR介导的Mas受体减少将导致细胞内Ang II含量上升。已有研究表明，Ang II参与肾脏血管受到外源性或内源性损伤后的重塑。在重塑过程中肾小球毛细血管内皮细胞的丢失能够直接影响肾小球的滤过功能，同时激活血小板和凝血系统，这些变化与肾小球毛细血管的塌陷及肾小球硬化的发展相关。Yisireyili等[13]研究显示在大鼠主动脉细胞和人主动脉平滑肌细胞HASMCs中IS上调前肾素受体(prerenin receptor，PRR)表达，诱导血管细胞增殖和纤维化，并通过ROS/OAT3/AhR/NF-κB途径促进PRR与前肾素分泌和结合，使血管紧张肽原向Ang II转化，Ang II可引起肾上腺皮质球状带细胞合成和分泌从而促进肾小球硬化的醛固酮。肾小球硬化将引起肾单位生理结构破坏和功能改变，进而发展为慢性肾衰竭。

肾小球基底膜是肾小球滤过功能的第二屏障。它是由内皮细胞和上皮细胞分泌物融合而成，具有复杂的结构。类似于内皮细胞，GBM带负电荷，对过滤的物质具有电荷选择性。同时机体通过收缩这些细胞来调节肾小球滤过率，并调节细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的合成和降解。ECM由细胞自身分泌到胞外间质中的大分子物质组成，其含量在肾脏中处于动态平衡，当ECM的产生大于降解量时将会导致沉积，如I型和IV型胶原，层粘连蛋白和纤维连接蛋白，在肾小球系膜区和细胞间隙的沉积会改变细胞结构，引起肾小球硬化[14]。Parrish等[15]证明，AHs可以通过AhR诱导GMC的线粒体损伤、干扰线粒体功能和谷胱甘肽稳态，并可以选择性地耗尽GMC中细胞的谷胱甘肽。

足细胞(肾小球上皮细胞)是终末分化细胞，是肾小球滤过功能的第三道也是最后一道屏障，是维持肾小球正常功能的重要细胞组成部分。然而，在各种致病因素的作用下，足细胞是肾小球中最易受到损伤的细胞，在糖尿病、IgA和高血压肾病中其损伤程度与肾病的严重性成正比，会引起肾小球硬化和相关疾病发展[16]。IS引起小鼠足细胞的形态变化，诱导更多的梭形和应力纤维肌动蛋白细胞骨架的重组。对正常小鼠的肾组织免疫荧光检测，发现AhR的表达局限于足细胞的细胞核，IS暴露两个小时后AhR被激活，肾小球中CYP1A1的含量升高[17]。表明足细胞可能是循环中内源性AhR配体的靶点。Ichii等[17]发现IS可通过激活AhR对足细胞产生损伤，使磷酸化Rac1/Cdc42增加，增加细胞的丝状伪足结构，促进细胞运动和迁移，出现炎症表型，扰乱肌蛋白骨架。Rac1和Cdc42都是Rho蛋白家族的成员，它们均能与GTP和GDP结合，在哺乳动物的信号转导系统中发挥着“分子开关”的作用，而Cdc42可以通过调节蛋白诱导EMT发生。

2 AhR介导血管损伤

肾脏内含有丰富的血管系统，环境污染物以及尿毒素引起的血管炎症，血栓、动脉粥样硬化等能引起血流动力学、代谢和免疫异常，刺激肾小管周围毛细血管及血管内皮细胞，导致内皮细胞活化，氧自由基增多等一系列生理病理反应，产生的血管疾病与CKD相互作用进而加速肾脏疾病的进展[18]。AhR介导的血管的氧化应激和炎症反应[19]，在内外源物质导致的血管疾病中同样起着重要作用。

2.1 AhR介导血管炎症炎症过程的一个重要特征是白细胞通过黏附和穿越血管内皮细胞，向炎症部位渗出。选择素是一类重要的黏附分子，主要介导白细胞与血管内皮细胞的起始黏附。Ito等[19]发现IS和IAA通过AhR诱导细胞氧化应激激活Jun-N-终端酶和激活蛋白-1，协同促进内皮细胞选择素(E-selecin)表达上升。E-selectin是一种由细胞因子激活的仅在内皮细胞上表达的细胞黏附分子，加剧白细胞和内皮细胞相互作用，引发炎症。Oesterling等[20]用AhR的激动剂β-萘芬处理HUVEC细胞后，苯并芘(benzo(a)pyrene,BaP)能增加细胞间粘附分子ICAM-1的分泌；而通过干扰RNA抑制AhR基因表达，或用AhR拮抗剂α-萘芬可消除BaP诱导的ICAM-1。Dou等[21]发现IAA通过增加ROS产生介导内皮细胞氧化应激，并通过AhR诱导激活p38 MAPK/NF-κB炎症反应信号通路，活化COX-2。在CKD动物模型中COX-2的表达与促炎反应相关，参与前列腺素E2的合成，在动脉粥样硬化中发挥着重要作用。

2.2 AhR介导血管硬化和栓死动脉粥样硬化被认为是一种血管壁的慢性炎症性疾病，其特征是趋化因子驱动的人外周血的单核细胞募集到内皮细胞下空间，在该部位单核细胞分化为巨噬细胞。在单核细胞中IS通过激活AhR/Nrf2信号通路促使细胞发生免疫应答，分泌白细胞介素-6、COX-2、白细胞介素-10、TGF-β等炎症因子，导致单核细胞分化为低炎症，纤维化的巨噬细胞，有助于造成慢性炎症和不良血管重塑[22]。这些巨噬细胞通过分泌许多炎症介质，如细胞因子和趋化因子，促进斑块的发展。Dalei等[23]发现，TCDD通过AhR诱导U937巨噬细胞内皮生长因子上游基因CXCR2的表达，且CXCR2抑制剂和AhR拮抗剂可降低TCDD诱导的载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)敲除小鼠早期动脉粥样硬化病变的过程。体脂积累过多也是动脉粥样硬化性血管疾病的主要原因，Violeta等[24]发现注射PCB-77后ApoE-/-小鼠的体重增加，脂肪细胞肥大，血脂异常，动脉粥样硬化加重。PCB-77给药增加野生型小鼠的体重，但不增加AhR-/-小鼠的体重；低浓度PCB-77或TCDD增加脂肪细胞分化、甘油-3-磷酸脱氢酶活性，AhR拮抗剂α-萘黄酮可消除PCB-77的作用。Gondouin等[25]发现CKD患者血液中组织因子(tissue factor，TF)的含量高于健康人群。TF广泛表达于各种组织，是凝血过程的启动者，正常情况下，组织因子位于血管壁外膜细胞，而在血管中膜或内膜层却很稀少。当血管壁的完整性遭到破坏时TF才暴露于循环血液，通过激活凝固级联反应发挥止血作用。IS和IAA通过AhR阻止血管内皮细胞中TF泛素化，使循环中TF水平显著增加，引发血栓形成，进而影响血液流动，甚至可导致血管完全阻塞[25]。

血管系统是肾脏发挥正常功能的执行者，尿毒素在肾脏累积的实质是血液累积，肾脏和心血管疾病通常存在有害的反馈共存，他们相互间并不是独立的系统。因此对于CKD除关注肾脏本身外，对心血管相关疾病的研究也是人们了解其致病机制的关键点。

3 AhR活性天然产物的肾保护作用

综上可见，AhR是各种内外源化合物引起CKD，产生肾脏损伤的关键因子。日常饮食是人类接触AhR配体的最大来源，各种天然膳食化学物质已被证实具有AhR活性，可通过激活或抑制AhR信号通路对肾脏产生保护作用。这说明AhR兼具介导化合物对肾脏的损伤效应和药物对肾脏保护的双重作用。AhR在肾脏疾病的发生和保护过程中发挥重要作用，然而对AhR信号通路进行调控是否能预防或恢复肾损伤的研究还较少。

传统中药大黄、雷公藤、川穹、黄芪等的复方制剂或提取物具有缓解GMC异常增生、肾小球硬化，保护内皮血管，抗氧化损伤，促进肾小管再生修复等功能[26]。从植物种分离的天然化合物，如白藜芦醇，小檗碱等的肾脏保护功能也已在多种细胞和动物模型中被证实，可减轻肾脏病理损伤，对肾脏炎症、纤维化、氧化应激损伤等产生保护作用，改善肾功能[27-28]。这些天然化合物中有许多为AhR的激动剂或拮抗剂。已知正常的饮食水平下，部分黄酮类化合物可以有效地抑制TCDD与AhR的相互作用，进而抑制TCDD的毒性[29]。例如山奈酚是黄酮类化合物的一种，可以下调BaP损伤模型中凋亡基因及AhR基因的表达，从而抑制BaP导致HTR8-SVneo细胞的氧化损伤，通过提高抗氧化酶SOD活性，降低脂质过氧化物MDA、NO的产生来减少BaP损伤[30]。虽然目前没有明确的证据表明这些天然化合物是通过AhR对肾脏产生保护作用，但基于AhR在肾脏生理病理过程中所扮演的重要角色，有必要对AhR在肾保护方面的潜在作用进行更深入的研究。

4 总结

综上所述，AhR在CKD的发生发展过程中具有重要作用，一方面AhR不仅可以介导内源性代谢产生的PBUTs和外源性环境污染物所导致的多种肾脏固有细胞的损伤或转化功能异常，从而引起肾纤维化与肾小球硬化；还可以在肾血管内皮细胞中介导这些毒性物质所导致的氧化应激及炎症反应，从而产生血栓、血管硬化等肾血管病变，协同加速肾功能的损伤(Fig1)。另一方面，肾脏的损伤使具有AhR活性的PBUTs在体内的累积，在加重肾脏损伤的同时还可能通过肾外组织中的AhR促进CKD并发症的发生(Fig1)。因此，深入系统的掌握AhR在CKD病程中的作用，可以为特异性阻断相关的毒性通路，并形成有效的疾病干预手段提供理论支撑。此外，针对目前已有文献报道的AhR活性天然产物开展肾保护作用研究，可以为基于AhR靶点的CKD干预药物的研发提供潜在的活性化合物库。

Fig 1 Mechanisms for AhR mediated nephrotoxicity and renal protection