利用分子辅助选择聚合抗稻瘟病基因选育黑糯稻新品系

陈萍萍 游月华 江 巍 戴展峰 彭玉林 黄水明

（龙岩市农业科学研究所 福建龙岩364000）

稻瘟病具有多种生理小种， 是水稻生产的主要病害，病情严重时，会影响水稻的产量和品质，给粮食生产造成重大的损失，高发区可以造成50%以上减产[1]。 但稻瘟病生理小种变异快，一个单基因的抗病品种育成后，往往种植2～3 年后就容易丧失抗性[2-3]。品种抗病性之所以丧失， 关键在于品种或抗源过于单一化， 通过将几个抗稻瘟病基因聚合于同一个水稻材料中， 可以有效地避免或减缓水稻抗稻瘟病抗性能力丧失。 刘士平等[4]发展了与Pi-1连锁的SSR标记RM144, 并利用分子标记辅助选择将Pi-1基因导入珍汕97B。吴金红等[5]开发了与Pi-2紧密连锁的SSR 标记AP22。 陈红旗等[6]利用分子标记技术聚合Pi-1、Pi-2和Pi-33基因改良金23B 的稻瘟病抗性，获得了高抗稻瘟病的保持系， 其对稻瘟病的抗病频率为96.7%。 孙富等[7]利用分子标记辅助聚合稻瘟病抗性基因Pi-1和Pi-2改良红色特种籼稻桂红一号的稻瘟病抗性，获得了具有高抗稻瘟病的改良材料。

本研究利用稻瘟病抗病基因Pi-1、Pi-2和Pi-b的紧密连锁的标记对育种分离世代水稻材料进行分子辅助育种选择，并结合田间农艺性状、稻瘟病抗性鉴定，快速、准确选育出聚合Pi-1、Pi-2和Pi-b3 个抗稻瘟病基因的黑色糯稻新品系。 选育聚合多个抗稻瘟病基因的水稻品种，是避免或减缓品种抗性丧失的有效途径，通过分子辅助选择结合田间育种技术，选育新的抗稻瘟病品种，为水稻抗病遗传育种提供新的供体亲本资源。

1 材料与方法

1.1 水稻材料

中组14 是中国水稻研究所选育的抗白叶枯病、稻瘟病、褐飞虱和白背飞虱，且米质达到国标1 级的常规籼稻品种， 携带稻瘟病抗性基因Pi-1、Pi-2和Pi-b，具有持久高抗稻瘟病特性，种子由浙江省农科院作核所提供。 岩紫糯是由龙岩市农科所选育的种皮颜色黑、营养品质高、产量较高的紫黑糯品种，稻瘟病抗性差。 龙岩市农科所选育的由中组14 与岩紫糯杂交、回交选育的优质有色稻中间材料。

1.2 抗性基因连锁标记

由表1 可知，与紧密连锁稻瘟病抗性基因Pi-1、Pi-2和Pi-b紧密连锁的标记分别是RM144、AP22和Pibdom[4-5,8]。

表1 水稻稻瘟病抗性基因的连锁标记及引物序列

1.3 杂交、回交与选择方案

以岩紫糯为母本，中组14 为父本，杂交获得F1，然后以岩紫糯为母本与F1回交获得BC1F1。为加快改良进程，在此后的自交选育过程中，通过单株的表现和分子标记检测结果， 在各自交世代中选择同时携带Pi-1、Pi-2和Pi-b3 个抗性基因且农艺性状优良的单株，最后获得抗稻瘟病的株系（图1）。

图1 分子辅助选择聚合3 个水稻稻瘟病抗性基因的育种程序

1.4 稻瘟病抗性鉴定

2018 年晚季田间稻瘟病自然诱发鉴定圃设在福建省上杭县茶地国家稻瘟病鉴定中心圃进行。 所用的菌株为福建省高感的菌株。 每个品种播种1 条，3 个重复，每条播种100 粒，四周设诱发行，以广陆矮4 号、明恢86 和本地糯稻龙黑糯2 号为诱发品种。不喷施农药，施氮肥，施用量高于普通大田20%。 出苗后30 d 人工喷施菌液使其充分发病。 按国际水稻所0～9 级的分级标准调查苗瘟、 叶瘟和穗颈瘟发病情况，调查方法参照郑轶等[9]的方法。

1.5 农艺性状及植株色素沉积和分布规律

1.5.1 农艺性状 考察农艺性状。

1.5.2 植株色素沉积和分布规律 用数码单反相机观察拍摄水稻不同生长阶段、 不同组织部位的色素沉积和分布规律， 记录不同发育天数的颖果的形态和色泽变化。

2 结果与分析

2.1 分子标记筛选

利用与Pi-1、Pi-2和Pi-b紧密连锁的 SSR 标记RM144、AP22 和 Pibdom 对中组 14 与岩紫糯进行多态性分析， 中组14 与岩紫糯之间具有明显的多态性。 结果见图 2。 另外，对分子标记 RM144、AP22 和Pibdom 用于对水稻植株抗病选择的可靠性进行了分析， 选用单个特异鉴别菌株对F2群体接种，RM144、AP22 和 Pibdom 对基因Pi-1、Pi-2和Pi-b基因筛选准确率达 90%。 说明利用 M144、AP22 和 Pibdom 分别对Pi-1、Pi-2和Pi-b基因进行分子辅助选择改良水稻品种抗病性是完全可行的。

图2 部分水稻植株抗性基因连锁标记在BC1F3 群体中的分离

2.2 利用分子标记选择抗稻瘟病株系

利用与抗性基因紧密连锁的标记对不同自交世代进行选择，结果见表2。 在BC1F1中，杂合带型（带型 2）与感病带型（带型 1）的分离比例符合 1∶1。 在BC1F1的自交群体中，根据分子标记检测结果、农艺性状表现和种皮颜色分别选择3 株种皮为黑色的单株进行繁殖获得BC1F2株系种子。 继续种植3 个BC1F2群体，对这些世代进行分子标记检测，各个分离世代均出现3 种带型， 即与供体亲本相同的纯合抗病带型、 抗感杂合带型和与受体亲本相同的纯合感病带型， 分离比例符合 1∶2∶1。 通过对农艺性状观察， 筛选获得5 个纯合抗病带型种皮为黑色的水稻株系。

表2 BC1F1 和BC1F2 群体的分子标记检测分析结果

2.3 聚合后代的抗性表现和农艺性状系统选育

2018 年晚季， 将获得的5 个稳定株系分别种植BC1F4群体，编号16-1～16-5。用福建稻瘟病高致病菌种对不同株系进行稻瘟病的苗瘟、 叶瘟和穗颈瘟的接种鉴定。 结果表明，5 个株系对高致病菌株均具有抗病能力，其苗瘟和叶瘟均为0 级，株系16-2 穗颈瘟 0 级，株系 16-1、16-3、16-4、16-5 穗颈瘟 1 级，综合抗性评价为高抗稻瘟病（表3）。

表3 16-1~16-5 株系的抗性鉴定

同时调查5 个株系的农艺性状，其中株系16-1 和株系16-2 农艺性状表现稳定一致，丰产性最好（表4）。2019 年将这2 个株系进行小区品比试验， 其中株系16-2 综合性状表现优异，暂时定名为龙黑198。

表4 株系16-1~16-5 农艺性状比较

2.4 龙黑198 的农艺性状与色素沉积与分布特征

2.4.1 龙黑198 的农艺性状 优质多抗稻瘟病新品系龙黑198 综合性状好，全生育期136 d，属于黑色籼糯类型。株型适中，株高138～142 cm，抗倒性强；分蘖性好， 单株成穗 9～12 个， 属于散穗型， 每穗粒数 175～200 粒， 结实率 85.7%， 千粒重 25 g， 高抗稻瘟病。

2.4.2 龙黑198 的色素沉积与分布规律 为了揭示龙黑198 黑色色素的积累特征，本研究观察龙黑198在不同生长阶段、不同组织部位的色素沉积与分布。在整个生长周期内， 龙黑198 的茎秆和叶片均为绿色；稻穗发育早期颖壳有紫色色素沉积，颜色由浅变深， 抽穗后颖壳颜色逐渐由紫色转为绿色进行光合作用（图 3A、B）；柱头为白色，无色素沉积（图 3C）。随着颖果灌浆，颖果发育早期（花后1～7 d），颖壳呈绿色，随着颖果灌浆成熟，颖壳色素的积累，颜色由绿变红， 进而由红变紫变黑； 成熟时颖壳颜色为黑色（图3D、F）。 通过仔细观察颖果果皮的色素沉积后，发现花色素在颖果果皮中的沉积具有时序性， 在花后5～7 d 有色稻颖果果皮尖端就开始出现色素沉积，然后延伸到颖果两端及背部维管束处的果皮沉积色素，后向整个颖果的果皮扩展，最后才是颖果中部和腹部沉积色素（图3E），一般在花后10～15 d 内整个颖果的果皮充满色素，随着色素的沉积，颜色由红变紫变黑，逐渐加深。

图3 龙黑198 色素沉积与分布规律

3 讨论与结论

Pi-b是第一个被图位克隆的抗稻瘟病基因。Pi-1与Pi-2是2 个显性广谱稻瘟病抗性基因， 具有有良好的互补效应[6,10-11]。 通过接种75 个来自不同地域的稻瘟病菌株， 结果表明，Pi-1和Pi-2的抗谱分别高达 82.67%和 85.53%[12]。Pi-1对南、北方稻区 322 个单孢菌株表现为中等毒力，毒力频率为22.36%，Pi-2表现为弱毒力，毒力频率为6.83%[13]。 携带Pi-2的水稻品系IRBLz5-CA 对来自广东的146 个稻瘟病菌株的抗性频率为48.6%，携带Pi-1的水稻品系IRBL1-CL抗性频率为80.1%，二者对不同生理小种的抗性具有很好的互补效应[14]。

本研究将Pi-1、Pi-2和Pi-b基因聚合到感病的紫黑色糯稻岩紫糯中，人工接种鉴定结果表明，聚合了3 个抗稻瘟基因的水稻株系能够抗福建省内高致病菌株的侵染，自然病圃苗瘟和叶瘟均为0 级，穗颈瘟0～1 级，综合评价达高抗稻瘟病水平。 研究表明，多个抗稻瘟病基因聚合后， 其抗性抗谱并不是单个抗稻瘟病基因之间的简单累加， 而是通过基因间的互作效应，增强单个抗稻瘟病基因抗性能力，在聚合2～3 个抗稻瘟病基因后，水稻品种的抗性抗谱能够增强拓宽。 多个抗性基因聚合是培育具有持久抗性水稻品种的有效方法，柳武革等[10]聚合Pi-1和Pi-2基因改良GD-7S 两系不育系的稻瘟病抗性， 获得5 个带Pi-1和Pi-2基因的纯合株系，其稻瘟病抗性较原始GD-7S 有大幅度提高。王军等[15]聚合Pi-ta和Pi-b抗稻瘟病基因，选育出多抗高产的优质水稻新品系。本研究通过将Pi-1、Pi-2和Pi-b3 个抗稻瘟病基因聚合到优质、感稻瘟病的紫黑糯，获得5 个高抗稻瘟病的株系，结合农艺性状筛选出抗稻瘟病、优质的黑色糯稻新品系龙黑198。