基于网络药理学分析真武汤治疗类风湿关节炎的作用机制▲

熊海风 刘若雅 李任城 杨 博 黎启航 占华松 杨 渊

(1 广西中医药大学研究生院，广西南宁 530001，电子邮箱：496095683@qq.com；2 广西医大开元埌东医院骨科，广西南宁 530021)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以对称性关节炎症为特征，导致软骨破坏、骨侵蚀甚至残疾的慢性自身免疫性疾病[1]。目前，本病的确切病因以及病理机制仍未明确，研究表明多种遗传因素和环境因素作用于关节滑膜、软骨、关节囊等部位，可导致关节腔内炎性反应，从而引起RA及其一系列并发症的发生[2]。RA的主要临床症状包括关节疼痛、肿胀、功能受限，此外，还可出现明显的晨僵和类似增生性关节病的关节僵硬现象。西医中，RA的总治疗目标是完全缓解(至少显著降低疾病活动性)时间控制在6个月以内，以预防关节损伤、残疾和全身表现[3]。为达到此目的，一般选择糖皮质激素、改善病情抗风湿药物(disease-modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs)、非甾体抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)、生物制剂等药物治疗[4-7]。但这些药物各有缺点：糖皮质激素疗效最差，且副作用众多[8]；DMARDs所引起的不良反应大[5]；NSAIDs则只能减轻疼痛和肿胀并改善关节功能，但不能防止额外的关节损伤，对疾病无治愈效果[6];生物制剂[7]价格昂贵，且副作用较多。因此，急需寻求新的方法治疗RA。

祖国中医药传承历史悠久，对于临床上多种疑难杂症的治疗颇有疗效，且具有治疗费用低和毒副作用较小等优点，故利用中医药辨证论治RA是一条可探寻之路[9]。根据RA的致病特点，祖国中医药将其归类为“尪痹”范畴[10]，其中“尪”始出于张仲景所著《金匮要略》“中风历节病篇”中所言的历节病，“诸肢节疼痛，身体尪羸”。《辞源》为其注曰： “骨骼弯曲症，胫、背、胸弯曲都叫尪。”“痹”即痹病。因此，“尪痹”指具有关节疼痛、变形、僵硬、屈伸不利以及肌肉萎缩等症状的痹病。根据不同病因病机及临床症状，RA可以分为肾虚寒侵、寒湿痹阻、痰瘀痹阻、瘀血阻络等不同证型。根据不同证型，遣方用药也不尽相同，其中真武汤亦是治疗尪痹的经典方剂之一。真武汤见于张仲景所著《伤寒杂病论》，具有温阳利水之功效，故可治疗RA中属肾虚寒侵之证者。然而，真武汤治疗RA的作用机制尚不明确。故本研究利用网络药理学方法，对真武汤治疗RA的主要成分、靶点、通路进行分析，进而预测真武汤治疗RA的药理作用机制，旨在为临床治疗RA提供新的思路与方向。

1 资料与方法

1.1 真武汤有效化学成分与作用靶点的筛选 通过中药系统药理学数据库与分析平台(https://tcmspw.com/news.php)对真武汤中的茯苓、白芍、生姜、附子、白术5种中药进行检索，以药物口服利用度≥30%、类 药 性≥0.18作为筛选条件，筛选出5种中药的化学成分。将得到的化学成分通过DrugBank数据库(https://www.drugbank.ca/)进行靶点预测，删除无法预测到作用靶点的化学成分，保留有效化学成分及其靶点。在UniProt数据库(https://sparql.uniprot.org/)中，设定“Human”及“Reviewed”为筛选条件，获取靶点对应的基因名称文件，最后通过Perl软件(https://www.perl.org/)将预测靶点与基因名称建立联系。

1.2 真武汤有效化学成分-药物靶点基因网络的构建 为方便作图，将筛选出的有效化学成分以拼音首字母和数字为组合进行编号，将筛选得到的有效化学成分编号与药物靶点基因导入Cytoscape软件(http://www.cytoscape.org/)中，构建出有效化学成分-靶点基因网络；然后使用网络中Network Analyzer工具进行网络拓扑结构分析，通过设置节点的度值(Degree)大小与节点图形大小呈正相关来体现节点在网络中的重要程度(而图形中Degree越大，则节点图形越大)。

1.3 RA相关疾病靶点的预测 在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)中检索“Rheumatoid Arthritis”，收集与RA相关的疾病靶点基因，通过Relevance score值大小(中位数以上)作为筛选条件，去除冗杂，筛选出相关度更高的靶点基因。

1.4 药物-疾病共同靶点的确定及蛋白-蛋白互作网络的构建 通过R语言4.0.0版(https://www.r-project.org/)将真武汤药物靶点基因与RA疾病靶点基因取交集，并构建Venn图，其中交集的靶点基因可能是真武汤中药物治疗RA的关键靶点。将交集靶点基因导入Cytoscape软件，构建蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)网络，并以网络度(degree)值>61、介数(betweenness)值>2100作为筛选条件，得到核心网络。

1.5 功能富集分析与通路富集分析 运用R语言及DAVID数据平台(https://david.ncifcrf.gov/)对获得的交集靶点基因进行基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析(设定P<0.05，Q<0.05)，进一步分析真武汤治疗RA的潜在作用机制。

1.6 构建KEGG关系网络 运用Cytoscape软件构建KEGG关系网络，然后使用Network Analyzer工具进行网络拓扑结构分析，从而使关系网络更数据化，并通过设置节点的Degree值大小与节点图形大小成正相关来体现节点在网络中的重要程度。

2 结 果

2.1 真武汤的有效化学成分及其对应靶点 针对真武汤5味中药，共检索出61个化学成分，其中茯苓15个、白芍13个、生姜5个、附子21个、白术7个。其中有36个化学成分未找到相关作用靶点，故去除。最终获得23个有效化学成分(茯苓6个、白芍8个、生姜1个、附子6个、白术4个，其中附子/白芍、生姜/白芍各重叠1个)，见表1。23个有效化学成分对应244个相关靶点，通过UniProt数据库和Perl软件，找到靶点对应的基因名称并建立联系，去除重复项后共获得对应靶点基因85个。

2.2 真武汤有效化学成分-药物靶点基因的网络图 将有效化学成分进行编号后，利用Cytoscape软件构建有效化学成分-靶点基因网络，见图1。该网络共包括115个节点和297个相互关系，根据Degree值，排名前5位的化合物分别是β-谷甾醇(MOL000358)、山柰酚(MOL000422)、木犀草素(MOL000296)、3β-乙酰氧基苍术酮(MOL000049)、石防风素(MOL002392)，见表1。

表1 真武汤有效成分信息

图1 真武汤有效化学成分-靶点基因网络

2.3 RA相关的疾病靶点基因及交集靶点基因的PPI网络 共获得RA相关的疾病靶点基因1089个。将1089个疾病靶点基因与真武汤有效化学成分的靶点基因通过R语言绘制Venn图(见图2),获得43个交集靶点基因，可能是真武汤治疗 RA的关键靶点基因。将交集靶点基因导入Cytoscape软件分析后得到PPI网络，然后筛选出核心网络，见图3。其中Degree值排名较前的靶点基因为热休克蛋白(heat shock protein,HSP)90AA1、雌激素受体1、血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM1)、雄性激素受体、转录因子P65等。

图2 Venn图

图3 交集靶点基因的PPI网络及核心网络

2.4 交集靶点基因的GO富集分析 运用R语言及DAVID数据平台对获得的交集靶点基因进行GO富集分析，根据每条项目的P值及基因数的不同，以P值及关联基因数升序排列，对其进行可视化处理，获得GO分析气泡图，见图4。结果显示，在生物过程中确定有841个GO条目，主要富集在对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、对营养水平的反应、对抗生素的反应等生物过程中。

图4 交集靶点基因的GO分析气泡图

2.5 交集靶点基因的KEGG通路富集分析 运用R语言及DAVID数据平台对获得的交集靶点基因进行KEGG通路富集分析，根据每条通路上富集基因数目及显著性的不同，以基因数目及显著性升序排列，对其进行可视化处理，获得KEGG富集分析气泡图。显著性表现为：P值越小，显著性越高(颜色越红)；关联基因数与GO上总基因数的比值越大，显著性越高(x轴值越大)。见图5。结果共获得107条通路，主要富集在流体剪切应力和动脉粥样硬化、在糖尿病并发症中的晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGE)-AGE受体(receptor of AGE,RAGE)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、白细胞介素(interleukin,IL)-17等信号通路，而图5显示的其他重要信号通路，无大量文献支持其与RA的相关性。所建立的KEGG关系网络中共有45个节点、203个相互关系(见图6)，从图中可看出，1条 KEGG通路往往可以富集到多个靶点基因，而1个靶点基因同时又可以出现在多条通路中。

图5 KEGG富集分析气泡图

图6 KEGG关系网络

3 讨 论

真武汤由茯苓、白芍、生姜、附子、白术5味中药组成，是温阳利水的经典方剂[11]，可有效治疗肾虚寒侵之证的RA。现代药理学研究表明，茯苓具有抗肿瘤、免疫调节、抗炎、抗氧化、抗衰老的作用[12]，白术具有抗肿瘤、抗炎的作用[13]，白芍具有免疫调节、抗炎的作用[14]，附子具有抗肿瘤、镇痛、抗炎等作用[15]，生姜具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用[16]。尽管现代药理学对真武汤中的5味中药已经有了较为深入的研究，但是其治疗RA的具体作用机制鲜有研究报告。

本研究结果显示，真武汤的有效化学成分中，节点的Degree值位列前5的为β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素、3β-乙酰氧基苍术酮、石防风素。其中，β-谷甾醇可以减少血管内的一氧化氮，并促进细胞钙的摄取，以此抑制巨噬细胞生成IL-6、髓过氧化物酶、腺苷脱氨酶，从而抑制IL-1β、TNF-α等炎性因子的分泌，最终发挥抗炎效果[17-18]。山柰酚可通过增加S期细胞数量以改变细胞的周期，从而介导细胞的凋亡，发挥其免疫调节、疾病预防方面的作用；同时，其可以通过促进成骨细胞的增殖和分化，以及降低抗酒石酸酸性磷酸酶和组织蛋白酶K的活力，抑制骨吸收，达到抗骨质疏松的作用；此外，山奈酚还有抗炎、抗氧化、降血糖、对损伤组织的保护等作用[19-20]。木犀草素具有体内外同时抗炎的作用[21]，其抗炎作用是通过多个途径来发挥的，主要包括抑制活性氧及一氧化氮的生成[22]，调节IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、TNF-α、干扰素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、IL-10等炎性因子及炎性介质水平[23]，影响核因子κB、 激活蛋白1、Janus激酶/信号转导与转录激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)等信号通路[24-26]。而3β-乙酰氧基苍术酮及石防风素的作用则少有相关研究报告。因此，β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素等成分可能在真武汤治疗RA的过程中发挥较为重要的作用。

在对药物靶点基因及疾病靶点基因的交集基因进行PPI分析后，发现其中Degree值排名较前的靶点基因为HSP90AA1、雌激素受体1、VCAM1、雄性激素受体、转录因子P65等。HSP90AA1可编码合成HSP90α，而HSP90α作为HSP90的亚型，除了在细胞内发挥作用外，还在伤口愈合和炎症中发挥分泌细胞外因子的作用。细胞外的HSP90α通过激活核因子κB和STAT3转录程序(包括促炎细胞因子IL-6和IL-8)，从而起到诱导炎症的作用[27]。VCAM1可增加白细胞与内皮细胞的黏附性，并为其迁入内皮下参与病理过程创造条件[28]。性激素在免疫反应及局部炎症反应中扮演着重要角色，其中雌激素可促进B淋巴细胞增加、协同促进T淋巴细胞的增加，以此加强免疫能力[29]；并且可通过降低如IL-1β、IL-6等炎性介质水平，达到抑制炎症的作用[30]。转录因子P65是核因子κB的亚基之一，其与P50共同组成核因子κB，而核因子κB是在RA患者中高表达的活化因子[31]，参与RA病程中的滑膜细胞增殖凋亡、炎性细胞因子的启动、免疫系统的调节[32-34]。由此可见，真武汤可能是通过调节HSP90AA1、雌激素受体1、VCAM1、雄激素受体1、转录因子P65等靶点基因来达到治疗RA的效果。

KEGG通路富集分析结果显示，交集靶点基因主要富集在流体剪切应力和动脉粥样硬化、在糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路等。RA的炎症反应会使IL-6、IL-1、TNF-α等促炎症细胞因子释放进血液循环系统中，再进入内皮组织中，从而引发血管内皮细胞的黏附，导致动脉粥样硬化等一系列心血管疾病[35]。流体剪切应力是内皮细胞接受的最主要力学刺激，通过改善流体剪切应力可保护内皮组织，从而减少血管内皮细胞的黏附并改善动脉粥样硬化[36]；同时，流体剪切应力可通过激活Wnt信号通路、细胞外信号调节激酶5信号通路等来达到促进骨细胞增殖分化及抑制骨细胞凋亡的作用[37-38]。而AGE与RAGE的相互作用是糖尿病并发症发生的最主要原因之一[39]。其中RAGE是细胞表面分子免疫球蛋白超家族的成员之一，其作为促炎性介质在炎症反应中起作用，AGE与RAGE相互作用后，可通过激活丝裂原活化蛋白激酶或核因子κB来上调IL-1β和TNF-α等炎性介质水平，从而引起炎症反应[39-40]。TNF信号通路和IL-17信号通路与RA的炎症反应有密切联系[41]，且已有大量研究证明，本文不再赘述。此外，GO富集分析结果显示，真武汤治疗RA主要涉及对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、对营养水平的反应、对抗生素的反应等生物过程。现有研究显示，脂多糖是革兰阴性细菌细胞壁的主要成分，其可作为生物效应器刺激宿主对细菌感染发生反应，免疫刺激作用较强；脂多糖可与位于细胞表面的Toll样受体4结合，当Toll样受体4识别脂多糖后，会刺激受体相关激酶及核因子κB，后者会上调炎性介质水平，进而引发炎症反应[42]。且有学者指出，RA患者对脂多糖的刺激敏感性增加，认为脂多糖可能在诱发RA发生的过程中起到重要作用[43]。由此推测，真武汤可能是通过改变流体剪切应力以保护内皮细胞、抑制炎症反应、调节免疫能力来发挥治疗RA的作用。

综上所述，真武汤可能是通过调节HSP90AA1、雌激素受体1、VCAM1、雄激素受体、转录因子P65等靶点基因，调控糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路等通路，从而保护内皮细胞、抑制炎症反应及调节免疫能力来治疗RA。这体现真武汤多成分、多靶点、多途径相互协同发挥作用的特点。但是受限于各平台数据库及软件功能，本研究仍有很多不足之处，故得到的结果还有待进一步实验研究的验证。