外周血辅助性T细胞9细胞因子与过敏性鼻炎患者疾病严重程度的相关性▲

何 玮 胡 敏 梁兴明 赵世杰 唐 军 杨强威 林华国 蓝 英 陈 龙

(广西南宁市第二人民医院耳鼻咽喉科，南宁市 530031，电子邮箱：a15677005435@sina.com)

过敏性鼻炎主要是由IgE介导组胺释放，并由多种细胞因子和免疫活性细胞参与的鼻黏膜炎性疾病，是一种临床较为常见的呼吸道过敏性疾病[1-2]。流行病学调查显示，我国过敏性鼻炎发病率一直居高不下，并且呈现逐年上升的趋势，其在青少年群体以及过敏体质群体发病率较高[3]。过敏性鼻炎的主要临床表现为鼻痒、鼻塞、喷嚏、清水样鼻涕，对患者的生活质量以及身体健康均造成严重的影响，但是目前过敏性鼻炎的发病机制尚未完全明确，因此，研究过敏性鼻炎的发病机制对患者的治疗具有重要意义[4]。本研究探讨辅助性T[淋巴]细胞(helper T cell，Th)-9细胞因子与过敏性鼻炎患者疾病严重程度的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年8月至2018年12月在我院门诊接受治疗的100例过敏性鼻炎患者。纳入标准：所有患者均符合中华医学会制定的过敏性鼻炎诊断标准[5]。排除标准：病历资料不全患者；呼吸系统恶性肿瘤患者；心、肾、肺等重要器官衰竭或功能不全的患者；有精神病史的患者。按照患者病情严重程度[6]分为轻度组36例、中度组49例、重度组15例。其中轻度组男性23例，女性16例，年龄25～41(33.1±6.3)岁；中度组男性27例，女性22例，年龄26～43(34.5±6.8)岁；重度组男性9例，女性6例，年龄26～42(34.1±6.3)岁。3组患者性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有患者及家属均对本研究知情并签署知情通知书，本研究已通过我院医学伦理委员会认可[伦申批号：(2020)伦审第(53)号]。

1.2 方法

1.2.1 标本采集：抽取所有患者治疗前清晨空腹手臂内侧静脉血3 mL，使用枸橼酸钠进行抗凝处理，采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单核细胞，并分两管收集，分别用于流式细胞术以及实时荧光定量PCR分析。另抽取所有患者治疗前清晨空腹手臂内侧静脉血5 mL，以3 000 r/min离心20 min后分离上层血清，在-70℃环境中保存待检。

1.2.2 Th9细胞比例的检测：将待测标本传代至孔板中，并在37℃、5%CO2的环境中进行培养2 h，加入0.25%胰蛋白酶消化，以2 000 r/min离心5 min后使用磷酸缓冲盐溶液清洗2次，共清洗3 min，再次以2 000 r/min离心5 min后收取细胞，加入1 mL碘化丙啶染液，在避光的常温环境中放置1 h，使用磷酸缓冲盐溶液进行洗涤5 min后在各管中加入150 μL固定剂，再加入0.5 mL磷酸缓冲盐溶液混合均匀制备为悬液，使用流式细胞仪[贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司，型号：CytoFLEX]检测Th9细胞比例。

1.2.3 转录因子PU.1及干扰素调节因子4 mRNA相对表达水平的检测：采用实时荧光定量PCR技术检测血浆转录因子PU.1及干扰素调节因子4(interferon regulatory factor 4，IRF4) mRNA相对表达水平，严格按照定量PCR仪(西安欧拓机电设备有限公司，型号：QTOWER2.2)的操作说明书进行检测。反应体系：稀释10倍的PCR缓冲液2.5 μL，氯化镁溶液1.5 μL，上游引物和下游引物各0.5 μL，最后加水配成25 μL。反应条件：94℃ 1 min；55℃ 1 min；72℃ 1 min，进行35个循环，72℃延长5 min，最少重复3次，以内参U6为参照，采用2-△△Ct方法计算PU.1 mRNA及IRF4 mRNA的相对表达水平。

1.2.4 白细胞介素9、白细胞介素4、转化生长因子β1水平的检测：使用酶联免疫吸附实验法检测血清白细胞介素(interleukin，IL)-9、IL-4及转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)水平，检测过程严格按照酶联免疫吸附实验试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，批次：20170201)说明书进行。

1.2.5 症状与生活质量进行评价：(1)入院次日，使用鼻结膜炎生存质量调查问卷(Rhinoconjunctivitis Quality of Life Questionnaire，RQLQ)评分[7]对所有患者的症状与生活质量进行评价，评价内容包括7个方面，共28个小项，分别为：(1)鼻部症状：鼻塞、鼻涕、喷嚏和涕倒流；(2)眼部症状：眼痒、流泪、眼痛和眼肿；(3)非鼻眼部症状：工作效率下降、注意力难以集中、精力不足、疲倦、疲惫不堪、口渴和头痛；(4)行为问题：需携带面巾纸、需揉鼻或眼和需反复吸鼻；(5)睡眠：入睡困难、夜间醒来次数和睡眠质量不高；(6)日常活动：根据列表中选择3项日常活动；(7)情感反应：沮丧感、无耐心或烦躁、易怒和因症状而感到尴尬。每个单项最高分为6分，得分越高说明疾病对患者造成的困扰越严重。(2)入院次日，使用视觉模拟量表(Visual Analogue Scale，VAS)评分[8]评价患者鼻部症状严重程度：在纸上划出10 cm长的直线，按毫米划格，一端为无痛，另一端为极痛。患者目测后根据自身情况以直线上无痛端为起点，用笔划出与其疼痛强度相符合的某点，测量点在直线上与无痛端的距离，重复2次，取平均值。按患者划出直线长短评价疼痛程度，其中0～2 cm为无痛，3～5 cm为轻度疼痛，有轻微疼痛感，6～8 cm为中度疼痛，有明显疼痛感，8 cm以上为重度疼痛，有剧烈疼痛感。

1.3 统计学分析 采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验；使用多因素Logistic回归分析Th9细胞因子与过敏性鼻炎患者疾病严重程度的相关性。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组患者外周血Th9细胞比例的比较 3组患者外周血Th9细胞比例由高到低为重度组>重度组>轻度组(均P<0.05)。见表1。

表1 3组患者外周血Th9细胞比例的比较(x±s，%)

2.2 3组患者血浆PU.1 mRNA、IRF4 mRNA相对表达水平的比较 重度组血浆PU.1 mRNA、IRF4 mRNA的相对表达水平均高于中度组与轻度组，且中度组血浆PU.1 mRNA、IRF4 mRNA的相对表达水平均高于轻度组(均P<0.05)。见表2。

表2 3组患者血浆PU.1 mRNA、IRF4 mRNA相对表达水平的比较(x±s)

2.3 3组患者血清IL-9、IL-4、TGF-β1水平的比较 重度组血清IL-9、IL-4水平、TGF-β1水平均高于中度组与轻度组，且中度组血清IL-9、IL-4、TGF-β1水平均高于轻度组(均P<0.05)。见表3。

表3 3组患者血清IL-9、IL-4、TGF-β1水平的比较(x±s)

2.4 3组患者RQLQ评分及VAS评分的情况 重度组RQLQ量表各项目评分和鼻部VAS评分均高于中度组、轻度组。见表4。

表4 两组研究对象症状及生活质量评分的情况(x±s，分)

2.5 多因素Logistic回归分析 以[(RQLQ评分+VAS评分)/2]为因变量(>3分赋值为1，≤3分赋值为0)，以PU.1 mRNA相对表达水平、IRF4 mRNA相对表达水平及血清IL-9、IL-4、TGF-β1水平为自变量(非正常水平均赋值为1，正常水平均赋值为0)进行多因素Logistic回归分析， 结果显示，血浆PU.1 mRNA相对表达水平、IRF4 mRNA相对表达水平及血清IL-9、IL-4、TGF-β1水平均是过敏性鼻炎严重程度的影响因素(均P<0.05)。见表5。

表5 过敏性鼻炎患者疾病严重程度多因素Logistic回归分析

3 讨 论

研究表明，Th细胞与过敏性鼻炎的发生发展密切相关，其中Th1细胞、Th2细胞在过敏性鼻炎的发病过程中均起到重要作用，这是由于Th1细胞能够调节干扰素γ的分泌，介导机体细胞免疫[9]，而Th2细胞能够调节IL-4、IL-5与IL-13的分泌，从而起到调节机体免疫的作用[10]。尽管Th1/Th2免疫平衡与过敏性鼻炎的发生发展密切相关，但是并不能充分解释过敏性鼻炎的发病机制。有学者认为，过敏原能够将CD4+的Th细胞激活并分化成为不同的T细胞亚群，在过敏性鼻炎的发生和发展过程中起到关键作用，Th9细胞是近年新发现的一种Th细胞亚群，许多专家学者开始致力于研究Th9细胞与过敏性鼻炎发病的相关性[11]。IL-9主要由Th9细胞分泌产生，Th9细胞及其分泌的IL-9与自身免疫性脑脊髓炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的发生发展密切相关[12]。IL-9能够激活信号转导和转录激活因子信号通路，促进调节性T细胞以及Th17细胞分泌，若阻断IL-9信号通路，会使调节性T细胞功能下降[13-14]。本研究结果显示，随着过敏性鼻炎患者病情严重程度的发展，其Th9细胞比例及血清IL-9水平亦随之升高，说明Th9细胞比例及血清IL-9水平与过敏性鼻炎的发生发展具有一定的相关性。

PU.1是E26转录因子家族的主要成员，是Th9细胞的特异性转录因子。有研究显示，PU.1能够使Th9细胞表型增强[15]。除PU.1之外，IRF4也是Th9细胞的特异性转录因子，在Th9细胞分化以及功能维持方面起到关键作用[16]。本研究结果显示，随着过敏性鼻炎患者病情严重程度的发展，其PU.1 mRNA与IRF4 mRNA相对表达水平亦随之升高，说明PU.1 mRNA、IRF4 mRNA与过敏性鼻炎的发生发展具有一定的相关性。

IL-4、TGF-β1也是Th9细胞的转录因子，与Th9细胞、IL-9水平变化密切相关[17]。研究表明，IL-4在过敏性鼻炎患者血清中呈现异常高表达，其水平变化与过敏性鼻炎的发生发展密切相关[18]。TGF-β1是一种重要的促纤维化生长因子，与过敏性鼻炎的发生发展密切相关[19-20]。本研究结果显示，随着过敏性鼻炎患者病情严重程度的发展，其血清IL-4、TGF-β1水平亦随之升高，说明血清IL-4、TGF-β1水平与过敏性鼻炎的发生发展具有一定的相关性。本研究多因素Logistic回归分析结果显示，PU.1 mRNA相对表达水平、IRF4 mRNA相对表达水平及血清IL-9、IL-4、TGF-β1水平均是过敏性鼻炎严重程度的影响因素(均P<0.05)。

综上所述，随着过敏性鼻炎病情严重程度的发展，患者Th9细胞比例、PU.1 mRNA相对表达水平、IRF4 mRNA相对表达水平及血清IL-9、IL-4、TGF-β1水平随之上升，且IL-9、PU.1 mRNA、IRF4 mRNA、IL-4、TGF-β1均是过敏性鼻炎严重程度的影响因素。