黄瓜新炭疽病原的鉴定及生物学特性初探

韩 帅，吴 婕，张河庆，梁根云，席亚东

（1四川省农业科学院植物保护研究所/农业农村部西南作物有害生物综合治理重点实验室，成都610066；2四川省农业科学院园艺研究所/蔬菜种质与品种创新四川省重点实验室，成都610066）

0 引言

四川省宜宾市常年种植黄瓜，是川南地区重要的黄瓜种植区，在当地调查黄瓜病害的过程中发现一种新的病害，症状类似炭疽病，有的田块全田发病，且病叶率过半，给当地农户造成了较大的经济损失。为解决这一生产问题，需对该病害进行准确鉴定。

引起黄瓜炭疽病的病原菌主要为瓜类炭疽菌(Colletotrichumorbiculare)[1]和平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)[2]，而 C.brevisporum 为害黄瓜未有报道。C.brevisporum的模式菌株分离自泰国的凤梨属植物，其培养性状为气生菌丝为白色、较稀疏，菌落背面为深绿色，培养后期有分生孢子堆；分生孢子为长柱型，透明无隔，表面光滑，内有油球，大小为(12～17)μm×(5～6)μm，孢子附着胞深褐色，卵形、纺锤形或不规则形，大小为(10～13)μm×(8～11)μm[3]。C.brevisporum可为害蔬菜和水果的叶片、茎部或果实，在四川引起辣椒炭疽病[4]；在福建为害百香果藤蔓，典型症状为产生椭圆或不规则形的褐色凹陷病斑[5]；在吉林引起南瓜果实炭疽病，病果表面散布近圆形的黑色凹陷坏死斑，湿度大时病斑上形成白色菌丝，同心轮纹处可见橙红色的分生孢子堆[6]；在海南引起咖啡树炭疽病[7]；在台湾引起木瓜炭疽病，于成熟果实表面可见水浸状或深褐色的凹陷斑，湿度大时可见橙红色孢子堆[8]；在巴西引起佛手瓜和木瓜炭疽病[9-10]，前者在果实上可见椭圆形的浅褐色或黑色的凹陷斑，后者症状与台湾分离物的相似；在韩国为害枸杞[11]；在泰国为害凤梨属植物和木鳖果[3,12]。

笔者于2019年在宜宾市蕨溪镇采集疑似炭疽病的黄瓜病叶，通过组织分离、柯赫氏法则验证、病原菌形态学和分子生物学鉴定，确定病原菌的种类，并对其进行生物学特性的研究，以期为当地黄瓜炭疽病的综合防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 仪器

光学显微镜(Olympus 51BX)，PCR仪(Bio-Rad T100)，凝胶成像系统(Bio-Rad Gel Dox XR)。

1.2 试验材料

1.2.1 植物材料 黄瓜品种为‘新选二早子’。

1.2.2 供试菌株 菌株编号为J1-1-2，分离自黄瓜病叶上，经单孢纯化保存于4℃冰箱备用。

1.2.3 培养基（1）马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂12 g，蒸馏水1 L。（2）水琼脂培养基：琼脂6 g，蒸馏水1 L。（3）燕麦琼脂(oatmeal agar，OA)培养基：燕麦片20 g，琼脂12 g，蒸馏水1 L。（4）麦芽浸膏(malt extract agar，EMA)培养基：麦芽膏40 g，琼脂12 g，蒸馏水1 L。（5）察氏(Czapek-Dox agar，CDA)培养基 ：NaNO33 g，K2HPO41 g，MgSO40.5 g，KCl 0.5 g，FeSO40.01 g，蔗糖30 g，琼脂12 g，蒸馏水1 L。（6）V8(V8 agar)培养基：V8果汁180 mL，CaCO33 g，琼脂12 g，蒸馏水1 L。（7）黄瓜煎汁培养基(cucumber juice agar，CJA)：黄瓜叶片10 g，琼脂12 g，蒸馏水1 L。（8）碳源培养基：NaNO31 g，K2HPO41 g，MgSO40.5 g，蔗糖（葡萄糖、麦芽糖、乳糖和可溶性淀粉）15 g，琼脂12 g，蒸馏水1 L。（9）氮源培养基：NaNO3（蛋白胨、酵母膏、NH4Cl和尿素）1 g，K2HPO41 g，MgSO40.5 g，蔗糖15 g，琼脂12 g，蒸馏水1 L。

1.3 病原菌的分离纯化

采用常规组织分离法进行病原菌的分离[13]。病样用清水洗净后自然风干，使用消毒剪刀截取病健交界处5 mm×5 mm的组织块，75%乙醇浸泡1 min，然后用5%次氯酸钠处理30 s，无菌水漂洗3次后用无菌滤纸吸干水分，将组织块转至PDA平板上，25℃黑暗培养。菌株纯化采用单孢分离法。使用无菌水冲洗菌丝制备孢子悬浮液，取上清涂布于PDA平板上，25℃黑暗培养3～4天挑取单菌落，转接于PDA斜面上，待长满后4℃保存。

1.4 病原菌的柯赫氏法则验证

待黄瓜幼苗长至2片真叶时，分别使用直径为6 mm的菌饼和浓度为1.0×105个/mL的孢子悬浮液（接种量为5 μL）在叶背面进行接种，分别接种15株，每株选择1片真叶，每片叶设置2个点，在25℃、85%相对湿度、16 h光照//20℃、90%相对湿度、8 h黑暗条件下进行培养，每天观察和记录发病情况。比较田间黄瓜病叶和回接后叶片的发病症状，同时截取病斑进行组织分离，比较新分离获得的菌株和原始菌株是否一致。

1.5 病原菌的形态学鉴定

将纯化后的病原菌接种于PDA培养基上，7天后观察并记录菌落以及分生孢子、刚毛和产孢器等结构的形态特征。孢子附着胞的诱导参照Yang等[14]的方法，将滴有孢子悬浮液的载玻片置于铺有棉花的培养皿上，加入适量无菌水保湿，25℃黑暗培养。菌丝附着胞的诱导参照Sutton和Cai等的方法[15-16]，吸取100 μL WA培养基滴加在无菌载玻片上，将直径约2 mm的菌丝块放置于WA培养基1/3处27℃保湿培养，5～7天后观察附着胞。

1.6 病原菌的分子生物学鉴定

病原菌总DNA的提取采用CTAB法。待菌株在PDA平板上长满后，轻轻刮取表面菌丝，使用液氮研磨至粉状，加入预热的CTAB液，于65℃恒温水浴30 min。冷却后加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提取上清，然后加入等体积的酚:氯仿(24:1)抽提2次。向上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，使DNA沉淀，使用70%乙醇洗涤2次，干燥处理后加入TE缓冲液溶解DNA，4℃保存备用。

使用引物 ITS1/ITS4[17]、ACT-512F/ACT-783R[18]和GDF/GDR[19]对相应的rDNA ITS、ACT和GDPH基因进行PCR扩增。25 μL PCR反应体系为：Taq PCR Master Mix 12.5 μL、正向引物和反向引物(10 μmol/L)各 0.5 μL、模板 DNA（约 30～50 ng/μL）1 μL、ddH2O 10.5 μL。PCR的扩增条件：98℃预变性5 min；98℃变性10 s，56℃退火10 s，72℃延伸10 s，共32个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳，使用凝胶成像系统进行观察和拍照。PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行纯化和测序，将测序结果和GenBank中已知种属的DNA进行Blast比对分析，同时下载相似的序列，使用MEGA 7.0软件，基于p-distance模型以邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树，经Bootstrap 1000次循环检验。

1.7 病原菌生物学特性研究

1.7.1 培养基对病原菌菌丝生长和产孢量的影响 将直径4 mm的菌饼接种于6种不同的培养基上，25℃黑暗培养，5天后使用十字交叉法测定菌落直径，待菌落长满皿后刮取表面菌丝，置于10 mL无菌水中充分震荡，3层无菌纱布过滤后使用纽鲍尔(Neubauer)血球计数板上测定分生孢子浓度，每个处理设置5个重复。

1.7.2 温度对病原菌菌丝生长和产孢量的影响 将菌饼接种于PDA培养基上，分别置于10、15、20、25、30、35、40℃共7个温度梯度下黑暗培养，7天后测定菌落直径，待菌长满皿后测定产孢量，培养条件和测定方法同1.7.1。

1.7.3 pH对病原菌菌丝生长和产孢量的影响 使用HCl(1 mol/mL)和NaOH溶液(1 mol/mL)将PDA培养基调至pH 4、5、6、7、8、9、10共7个梯度，7天后测定菌落直径，待菌长满皿后测定产孢量，培养条件和测定方法同1.7.1。

1.7.4 碳源、氮源对病原菌菌丝生长和产孢量的影响 5种碳源分别为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和可溶性淀粉，5种氮源分别为硝酸钠、蛋白胨、酵母膏、NH4Cl和尿素，7天后测定菌落直径，待菌长满皿后测定产孢量，培养条件和测定方法同1.7.1。

1.7.5 致死温度的测定 将直径为6 mm的菌饼置于装有1 mL无菌水的EP管中，将EP管分别放入40、42、44、45、46、47、48、49、50℃的水浴锅中处理10 min，然后转至PDA培养基上25℃黑暗培养，7天后观察菌丝的生长情况，每个处理设置6个重复。

1.8 数据处理

采用Excel软件和DPS v7.05软件进行数据统计和分析，使用Duncan新复极法比较差异显著性。

2 结果与分析

2.1 田间发病症状

在四川省宜宾市蕨溪镇的露地黄瓜进行病害普查，发现该地一种新的病害发生严重，病叶率达43.07%～51.37%。症状表现为病斑多角形或近圆形，呈褐色，边缘褪绿，中心渐变为苍白色（图1A）。

2.2 柯赫氏法则验证

通过组织分离及纯化获得1株分离物，编号为J1-1-2。使用菌饼接种叶片3天后，接种点出现褪绿斑（图1B），10天后病斑变褐，边缘黄化（图1C），这与田间症状相似；接种孢子悬浮液10天后出现边缘黄化的圆形褐斑（图1D）。对病叶进行组织分离，新获得的菌株与原始菌株相比，其形态学特征一致，表明该菌为引起黄瓜炭疽病的病原菌。

图1 田间及人工接种后发病症状

2.3 病原菌的形态学鉴定

菌株J1-1-2在PDA上的菌落呈黑色，气生菌丝为灰白色，较稀疏，培养基内密布小黑点（图2A）。通过显微观察可知分生孢子呈长柱形，透明无隔，有油球，大小为(14.4～18.4)μm×(4.0～5.8)μm(xˉ=(16.3±1.1)μm×(4.7±0.4)μm，n=30)，孢子附着胞呈卵圆形，浅裂，浅褐色，个别孢子能产生两个附着胞，大小为(7.8～10.6)μm×(6.8～9.9)μm(xˉ=(9.1±0.7)μm×(7.9±0.7)μm，n=30)（图2B）；分生孢子盘中着生黑色刚毛（图2C）；菌丝附着胞为不规则形，深褐色，浅裂或深裂，大小为(11.4～15.6)μm×(9.3～13.7)μm(xˉ=(11.9±1.7)μm×(8.6±1.3)μm，n=30)（图2D）。

图2 病原菌的形态学特征

2.4 病原菌分子生物学鉴定

使用引物ITS1/ITS4、ACT-512F/ACT-783R和GDF/GDR进行PCR扩增，分别获得长度为534、244、258 bp的扩增片段，将测序结果上传至NCBI数据库，获得相应的登录号(MT626673、MT636879、MW316323)，同时与GenBank数据库中的已知序列进行Blast比对，使用MEGA 7.0软件构建基于三基因序列联合的系统发育树，以Monilochaetes infuscans为外群，结果显示菌株J1-1-2与C.brevisporum(LJTJ24)和C.brevisporum(L57/LC0600)聚为一支，支持率为100%（图3），由此可知该菌为C.brevisporum。

图3 基于ITS、ACT和GDPH序列构建对C.brevisporum的系统发育树

2.5 病原菌生物学特性测定

2.5.1 培养基对病原菌菌丝生长和产孢量的影响 菌株J1-1-2在PDA培养基上生长最快，菌丝生长速度为(12.66±0.31)mm/d，其次为V8培养基，生长最慢的为黄瓜煎汁培养基。在OA培养基上产孢最多，产孢量为(144.45±25.07)×105个/mL，其次为PDA和V8培养基，其他培养基均不产孢（图4）。

图4 不同培养基对病原菌菌丝生长和产孢量的影响

2.5.2 不同温度对病原菌菌丝生长和产孢量的影响 菌株J1-1-2在10～35℃均能生长，40℃停止生长，最适生长温度为25℃，菌丝生长速度为(10.88±0.12)mm/d。在20℃和25℃能产孢，产孢量分别为(31.67±3.33)×105和(34.43±2.55)×105个/mL，无显著性差异，其他试验温度未产孢（图5）。

图5 不同温度对病原菌菌丝生长和产孢量的影响

2.5.3 pH对病原菌菌丝生长和产孢量的影响 菌株J1-1-2在pH 4～10的条件下均能生长，pH 8时生长最快，菌丝生长速度为(11.82±0.07)mm/d，在pH≤5时菌丝生长明显受到抑制。pH 6～10时均能产孢，最适产孢为pH 8，产孢量为(33.32±2.89)×105个/mL，该菌在碱性条件下更适合生长及产孢（图6）。

图6 不同pH对病原菌菌丝生长和产孢量的影响

2.5.4 碳源对病原菌菌丝生长和产孢量的影响 5种碳源对菌株J1-1-2的菌丝生长和产孢量影响差异明显，其中葡萄糖最有利于菌丝生长，生长速度为(8.14±0.40)mm/d，其次为可溶性淀粉、蔗糖和麦芽糖，生长最慢的碳源为乳糖。该菌能利用可溶性淀粉和乳糖产孢，且产孢量无显著性差异，其余碳源不产孢（图7）。

图7 不同碳源对病原菌菌丝生长和产孢量的影响

2.5.5 氮源对病原菌菌丝生长和产孢量的影响 5种氮源对菌株J1-1-2的菌丝生长和产孢量影响差异明显，其中蛋白胨和酵母浸粉最适合菌丝生长，且均能产孢，后者产孢量最多，为(608.89±54.38)×105个/mL，其余氮源不产孢（图8）。

图8 不同氮源对病原菌菌丝生长和产孢量的影响

2.5.6 病原菌致死温度的测定 当菌饼在40～48℃的水浴锅中处理10 min后，菌株J1-1-2在PDA培养基上仍能生长，当处理温度上升至49、50℃时，该菌停止生长，表明其致死温度为49℃。

3 结论与讨论

基于Sutton的分类系统，微观形态特征、纯培养特征和寄主范围是鉴定炭疽菌的重要指标。将模式菌株和国内已报道的菌株相比，本研究的分离物分生孢子长度在两者之间，宽度偏小，这种差异可能是由培养基基质种类或培养条件不同造成的[20]。孢子附着胞的大小与Liu等[4]分离自辣椒的菌株相比偏大，和杨友联等[21]报道的菌株基本一致，这可能与菌株来源、孢子附着胞的成熟度有关。吴文平和张志铭[22]认为菌丝附着胞体积较大，但种间和种内的形态差异也大，且诱发时间长，操作繁琐，而孢子附着胞虽然较小，但形态稳定，且操作简便，因此后者更适合作为分种依据。本研究的结果与之相似，菌株J1-1-2的孢子附着胞规格变化幅度显著低于菌丝附着胞，表明前者形态稳定、变异小，可作为该菌形态鉴定的分类指标。部分学者的研究结果也表明凭借孢子附着胞的形态学特征可以将Colletotrichumsp.、C.scovillei和C.acutatum与其他菌区分开[4,23]，可见孢子附着胞在炭疽菌属部分种的鉴定上有应用价值。在PDA培养基上菌株J1-1-2的生长速度与国内菌株基本一致，培养性状更接近于Lui等[4]分离的菌株，气生菌丝为浅灰色，菌落背面呈黑色。C.brevisporum的寄主广泛，包括辣椒、西红柿、南瓜、木瓜、豇豆、百香果等多种作物，但能否侵染黄瓜未有报道，杨友联等[21]在离体黄瓜果实上分离获得了2株C.brevisporum，但未做致病性测定，本研究表明C.brevisporum的菌丝体和分生孢子均能使黄瓜叶片发病，这是国内首次报道该菌是黄瓜炭疽病的病原菌之一。

炭疽菌某些近缘种种间形态和纯培养特征差异小，导致近缘种不易区分，且某些种种内的形态特征不稳定，致使同种菌株在不同培养条件下差异明显，因此，单纯使用形态学方法进行分类鉴定比较困难。随着分子生物学手段在真菌鉴定中不断应用和完善，炭疽菌的鉴定更为精准。核糖体转录间隔区序列(ITS)是最早应用于炭疽菌分类的DNA序列[24]，Wire等[25]对Colletotrichum gloeosporioide复合群中的22个种进行基于ITS的系统进化分析，发现有13个种不能被准确识别，表明ITS在炭疽菌近缘种的分类应用上分辨率较低。本研究的分离物仅通过ITS序列不能和C.gloeosporioide区分开，加入ACT和GDPH基因进行联合建树可准确鉴定到种。

就不同培养基、温度、pH和碳氮源等环境因素对菌株J1-1-2菌丝生长速度和产孢能力的影响进行测评，该菌在不同培养基上的培养性状差异明显，在PDA培养基和V8培养基上菌丝生长快，气生菌丝致密，且可以产孢，在OA培养基上培养5天即可产生黑色的分生孢子盘，产孢最多，但气生菌丝较少，表明产孢能力和菌丝致密程度没有相关性。该菌适宜的生长温度为25～30℃，20～25℃利于产孢，在10℃以下菌丝生长明显受阻，无气生菌丝，高于48℃时菌丝停止生长。碱性条件更适合菌丝生长且利于产孢。最适生长的碳源为葡萄糖，氮源为蛋白胨和酵母浸粉，后者产孢最多，碳源中可溶性淀粉和乳糖有利于产孢。关于C.brevisporum生物学特性的研究未见报道，本研究结果可作为参考。

笔者在对川南黄瓜主产区病害调查的过程中发现，在内江威远、乐山夹江、宜宾和泸州均有炭疽病发生，但主要是由C.orbiculare引起的，仅在宜宾蕨溪镇的病样上分离到C.brevisporum，关于该菌的来源及病害循环需作进一步研究。