绒毛白蜡耐盐碱响应机制的研究进展

范馨月，张 华，赵继业，杜子沫，丛日晨

（1北京市园林科学研究院，北京100102；2河北农业大学，河北保定071000）

0 引言

植物在遭受非生物胁迫时可以感应胁迫信号并且触发相应响应机制，通过改变自身的生长、代谢和发育过程来应对胁迫，以避免其受到伤害[1-2]。植物应对各种不同胁迫有不同的响应机制，但也会存在部分交叉。

土壤盐碱化是一个日益严重的全球性问题，造成土壤盐碱化的原因除了自然发生的土壤盐碱化，气候变化和不良的灌溉方式也被认为是主要因素[3]。粮农组织最近的一项报告显示，目前全球20%以上的灌区受到土壤盐碱化的影响，到2050年，这一数字将可能扩大到50%[4]。中国是盐碱地大国，2015年国家林业局调查国内盐碱土地面积为17.79万km2[5]，约占全世界的10%。

绒毛白蜡(Fraxinus velutina)又叫绒毛梣，属木犀科白蜡属，与其他白蜡对比，绒毛白蜡具有较强的耐盐碱能力[6]，在天津、秦皇岛等滨海地区表现良好，是优良的盐碱地造林树种，适用于滨海城市绿化。目前，关于绒毛白蜡的耐盐性的研究主要集中在耐盐品种的选育和培育以及生理特性上，对于绒毛白蜡在盐胁迫下的响应机制研究较少。耐盐碱基因的表达、渗透调节、离子的选择吸收等是绒毛白蜡耐盐碱的关键，探讨绒毛白蜡耐盐碱的生理和分子响应机制有利于通过分子手段改良品种，为乔木耐盐碱研究提供部分依据，丰富盐碱地绿化乔木树种。

1 盐碱胁迫对绒毛白蜡的影响

盐渍环境对植物的影响几乎囊括了从种子萌发到植株生长最后死亡的整个生命过程，盐胁迫会造成生理干旱、减弱叶片的光合作用、损坏细胞膜、造成代谢紊乱等，最终可能使植物营养不良甚至死亡[7]。

1.1 对种子萌发影响

种子能在盐碱地顺利萌发是植物具有耐盐碱能力的重要表现之一。研究表明随着胁迫的增强，绒毛白蜡发芽率基本上是先升高后降低。低浓度的盐胁迫可以适当提高绒毛白蜡种子的发芽率，高浓度则会抑制种子的发芽率。刘萍等对盐胁迫下未萌发的种子进行复水实验，表明在一定临界值内没能萌发的种子在复水实验后可以恢复萌发，恢复率达90%左右，但是当盐浓度超过临界值时，恢复率逐渐下降。说明绒毛白蜡的种子对于在一定临界值内的盐胁迫有一定的适应能力，且保持萌发的潜力[8-9]。虽然绒毛白蜡植株具有较强的耐盐碱性，但盐胁迫也会明显影响种子的形成质量，盐碱地种子千粒重仅为非盐碱地的78%。

1.2 对绒毛白蜡形态及生长的影响

盐分对植物整个生命周期都有较为显著的影响，盐胁迫会抑制组织和器官的生长，导致生长不良等[10]。在盐胁迫下，植物芽部和根部的生物量都会显著降低[11]。对盐胁迫下绒毛白蜡的各项生长指标的测定发现，在盐胁迫下，绒毛白蜡的株高、地茎以及叶片面积均随着胁迫强度的增大和时间的延长呈现下降趋势，在高浓度盐处理中，叶片开始出现干枯脱落现象。随着盐胁迫浓度的升高，植株整体和各器官的生物量均大幅下降，且降低的速度加快、幅度增大[12]。

1.3 对光合速率和叶绿素含量的影响

光合作用为植物提供生长所需能量。在盐胁迫下，绒毛白蜡的光合速率随盐浓度的增加而逐步降低。主要原因是光合作用需要吸收二氧化碳，而盐胁迫会造成气孔导度下降使叶片不能顺利吸收二氧化碳。此外，盐胁迫还会降低叶绿素含量，破坏叶绿体的结构。

叶绿体是植物进行光合作用的重要细胞器，在盐碱胁迫下容易受到影响。植物进行光合反应时起主要作用的色素是叶绿素。研究表明，盐胁迫会造成绒毛白蜡体内叶绿素含量的降低，叶绿素含量与胁迫强度呈反比。叶绿素含量下降的主要原因是叶绿素被叶绿素酶分解，同时光合酶受到抑制。另外盐胁迫还会破坏叶绿体的结构，盐胁迫下产生的大量自由基破坏了叶绿体质膜，阻碍了类囊体膜的形成，也破坏了类囊体膜的结构，使垛叠状态的类囊体膜比例下降[13]。

1.4 对细胞膜透性的影响

盐胁迫下细胞质膜最先受到伤害，盐胁迫导致膜脂过氧化，积累大量的丙二醛，使得细胞质膜透性增大，细胞膜的相对电导率增大[14]。

1.4.1 相对电导率 盐胁迫下植物的相对电导率是研究植物抗盐性的理想指标之一，细胞膜越完整相对电导率就会越低[15]。研究表明，盐胁迫会破坏白蜡叶细胞中的细胞膜系统，在盐碱胁迫对白蜡种子的研究中发现，在相同盐胁迫下，相比采于保定的白蜡种子，秦皇岛的白蜡种子具有更低的相对电导率，这说明采于秦皇岛种子的抗盐性更强，当地的滨海气候和土壤环境可能是诱因[16]。

1.4.2 MDA（丙二醛）植物体内丙二醛的含量是衡量细胞膜膜质过氧化程度的一个指标，也可以用来判断植物抗性的强弱。随着盐浓度和时间的增加，绒毛白蜡种子和叶片中的MDA含量增加，但叶片中MDA含量的增长速度不同，在绒毛白蜡受到盐胁迫的初始阶段，MDA的含量增长幅度较小且增速较慢，这可能是由于绒毛白蜡在盐胁迫初期会通过自身调控来降低盐胁迫对细胞的伤害，保护自身膜质不被破坏。但随着胁迫的增强，叶片中的MDA含量会呈现较大幅度的上升且增长较快，说明长时间的高盐环境会使自身调节机制受损，加快了细胞膜的过氧化进程[16-17]。

2 绒毛白蜡对盐胁迫的响应机制

2.1 绒毛白蜡响应盐胁迫的生理机制

2.1.1 形态结构对盐胁迫的适应性变化 在长期的生物进化过程中，几乎每种植物都形成了适应自身生长环境的形态结构，在盐碱环境下各类植物的结构也会为适应环境而产生一系列的变化。

绒毛白蜡叶片表面存在可分泌盐分的腺体，可以将盐分排出体外。在盐胁迫下绒毛白蜡的叶面积随着盐浓度的升高而降低，出现干物质大量消耗的情况，表现为生物量减小[18]，而且在盐胁迫下的绒毛白蜡叶片有肉质化趋势。盐胁迫不仅会影响植物茎叶等外部结构，也会影响植物的内部结构。在重度盐碱地的白蜡叶片的栅栏组织和海绵组织厚度的比值在所有树种中最大，海绵组织排列较为疏松，细胞间空隙会形成发达的通气组织，表现出对盐渍环境较强的适应性[19]。

根是从土壤中吸取营养的重要器官，根系的解剖结构与植物耐盐性有直接关系。研究发现，绒毛白蜡具有根系直径较大、侧根发达、延伸较长等特点，并且绒毛白蜡的根系有一定的避盐性[20]，且相比于正常生长条件，盐碱地的绒毛白蜡根茎比会增大，这可能是绒毛白蜡可以在盐碱环境下生存的原因之一。

2.1.2 离子转运与区域化 盐胁迫会引起离子毒害，对有害离子转运和区域化的限制可以有效减少危害。引起离子毒害的主要离子是Na+，相关研究已经发现了几种Na+转运方式[21-22]，如图1所示。

图1 植物细胞内Na+的4种转运方式

植物体内的Na+、Cl-的分布可以在一定程度上反映植物对于盐胁迫的耐受能力，在绒毛白蜡中Na+的分布大致为细根>主根>茎>叶，细根是直接从外界吸收水分以及营养物质的部位，是最先接触到Na+和Cl-的部位，因此是积累离子最多的部位。盐分主要积累在绒毛白蜡根的皮层外围细胞内，而且绒毛白蜡的叶肉细胞内有大液泡，也可以将离子区域化，这可能是绒毛白蜡具有较强耐盐能力的原因之一[23-24]。

2.1.3 渗透调节 渗透胁迫会造成植物缺水、植物气孔关闭、细胞扩张受到抑制、生长速度减缓等[25]。调节水势的方法主要有2种，一种是积累无机离子，另一种是积累有机渗透物质。细胞内有过多的无机离子的积累，会产生离子毒害，所以植物可以通过积累脯氨酸、可溶性糖等有机物渗透物质来调节渗透平衡[26-27]。

（1）可溶性糖。植物组织中普遍存在可溶性糖，种类较多，有葡糖糖、果糖等。绒毛白蜡体内的可溶性糖含量随着盐胁迫强度的增加而增加[12]。武德等[17]研究表明，在对绒毛白蜡进行盐胁迫的开始阶段，体内可溶性蛋白含量变化是先下降后逐渐增加，下降的原因可能是盐分将可溶性蛋白破坏分解成了氨基酸，之后含量增加可能是植物启动了自我防护机制，产生了一些可溶性蛋白以抵抗逆境，因此绒毛白蜡对盐胁迫有一定的抵抗和适应能力。

（2）脯氨酸。脯氨酸也是一种有机渗透物质，对提高植物的耐盐碱性有重要作用，还能增加植物体内抗氧化酶的活性[28]。闫文华等[29]研究表明，当盐胁迫的强度逐渐增大时，脯氨酸的含量也在逐步增加，在达到一定强度时，脯氨酸含量达到峰值，之后脯氨酸含量开始逐步减少，这可能是由于盐分对植物的伤害超出了植物所能承受的范围，渗透调节物质合成受阻。

2.1.4 保护酶的作用 在氧的代谢过程中会产后一种激发状态的氧分子被称为活性氧。活性氧具有很强的氧化能力，可引起细胞膜老化、造成不可逆的伤害甚至是细胞死亡[30]，超氧化物歧化酶(SOD)是植物清除活性氧的第一个屏障[31]，在保护酶系统中处于中心地位，另外还包括过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等保护酶。这些抗氧化酶活性可以作为反映植物抵御盐胁迫能力的关键指标。

研究表明，盐胁迫强度加大会引起绒毛白蜡体内的SOD含量呈先升高后下降的趋势，先上升的原因是，植物在遭受不良环境时为了使活性氧处于相对平衡的水平，会产生SOD清除植物体内多余的活性氧。但随着胁迫时间和强度的上升，SOD活性下降，表明SOD对植物的保护作用是在一定范围内的，超过一定限度植物的自我调节机制被破坏。

保护酶系统除SOD外还有过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)。研究表明，随着胁迫时间的延长，POD活性呈现“M”的趋势，POD可以有效清除植物体内的过氧化氢。推测在盐胁迫过程中，植株通过提高POD的活性来保护植物免受伤害，以提高绒毛白蜡的抗性。吴丽云等[32]通过对绒毛白蜡种子的研究表明，CAT活性随着盐胁迫强度的升高而增加。POD和CAT酶活性与盐浓度变化的关系还有待进一步研究。

2.2 绒毛白蜡响应盐胁迫的分子机制

2.2.1 差异表达基因 对于绒毛白蜡的耐盐碱性，无论国内外的研究大部分停留在生理生化层面，而对更加深入的分子调控机制方面研究较少，缺乏较为全面的研究和分析。目前已经有不同种白蜡在不同盐渍环境下的差异基因分析以及绒毛白蜡在不同胁迫时间下的基因分析。

通过对在盐胁迫下和对照组的绒毛白蜡和中国白蜡进行转录组测序，对差异基因进行分析，研究中检测了差异表达基因(DEGs)，并分析了相关信号通路，上调基因主要集中在生物碱合成、氧脂质的生物合成过程、嘌呤核苷酸转运、细胞铜离子稳态、果糖刺激产生植物类金属硫蛋白、光系统Ⅰ中的光合电子传递、类黄酮生物合成、促性腺激素信号通路、淀粉和蔗糖代谢等。下调的基因主要与光合作用、硒复合代谢过程、双受精形成合子和胚乳的过程以及苯丙类生物合成有关[33-34]。

研究通过对不同盐处理时间下(0.5、24 h)的绒毛白蜡进行表达谱分析，发现持续0.5 h盐胁迫的绒毛白蜡与对照组相比，并没有发现较多的差异表达基因，而当盐胁迫持续24 h后差异基因大量增多，说明要引起显著的基因表达量差异需要长时间的盐胁迫。且持续24 h盐胁迫与0.5 h相比差异基因中所涉及的功能显著增多。通过分析绒毛白蜡在不同胁迫时间下的差异基因，筛选出一些用于响应盐胁迫的关键基因，其功能主要有渗透保护物质合成、调节离子平衡、水通道蛋白合成、抗氧化酶的生成、激素信号转导、光系统保护和修复、转录调控等多方面[35]。

“怀旧”，一方面是两岸听众的审美特征，而另一方面也反映出当代华语流行乐坛存在的问题。如当前各个经纪公司在筹划歌手个人演唱会时，都在打“怀旧”牌，列出该歌手多年来唱过的经典曲目以增加演唱会的市场号召力，让歌迷到现场“见证青春岁月”。[29]这一方面证明了这些流行歌手的影响力，另一个方面也显示了整个流行乐坛一定程度上的青黄不接。[29]

差异基因所涉及的基因功能与上述生理相应机制有一定重叠，绒毛白蜡响应盐胁迫的调控机制很复杂，受多基因控制，涉及多种功能基因以及调控基因，并且与其他胁迫的响应机制存在交叉现象。

2.2.2 关键基因的分析

（1）FvNCED3基因。脱落酸(ABA)具有调节种子胚的发育、引起气孔闭合以及促进休眠和器官衰老等作用，可以增强植株对干旱、盐碱和高温等非生物胁迫的抗性。植物组织中内源ABA水平受脱落酸合成、羟基化代谢、可逆糖基化代谢以及ABA长距离转运等过程的动态调控[36-37]。ABA可以通过参与信号的传导来调控相关基因的表达，以增强对胁迫的应对能力[38]。

目前关于高等植物中ABA的合成途径已经较为清晰，如图2所示[39]。

图2 ABA合成途径

研究表明，盐胁迫使植物体内ABA的含量上升，基因NCED可以调控盐胁迫下ABA的合成[40]。目前已知的体内包含此类基因的植物除了绒毛白蜡外还有海棠、拟南芥、烟草等[41]。相关研究表明，在盐胁迫条件下NCED的表达水平越高则ABA含量越高，因此想增强植物的抗性可以通过提高NCED基因的表达水平来实现[42]，目前关于NCED基因在植物抵抗非生物胁迫方面的研究多数集中在干旱胁迫方面[43]。

研究人员已经分离和克隆出了绒毛白蜡体内的FvNCED3基因及其启动子，并且进行了基因功能分析。发现FvNCED3在不同组织中的表达存在差异，叶片中的表达水平高于根中。在转录水平上，在脱水、盐胁迫和外源ABA的作用下FvNCED3的表达量升高，在高温和低温胁迫下表达量降低，对紫外线无反应，在干旱和盐胁迫条件下，FvNCED3启动子诱导基因表达的能力显著增强，有效提高了报告基因的表达，表明FvNCED3可以通过对外界刺激的响应来增强植物下游基因的表达和抗逆性[44]。

目前ABA激活SnRK2s的机制基本被阐明，如图3所示。在正常生长条件下，蛋白磷酸酶PP2C会抑制SnRK2s的活性，而在植物遭受渗透胁迫时则会激发其响应机制。研究表明SnRK2主要激活ABA的上游。首先渗透压力通过一个假定感受器OSCA1来触发钙通道，Ca2+可以激活SnRK2s，导致ABA含量增加，ABA与受体PYLs结合可以抑制蛋白磷酸酶PP2C，从而激活第三类SnRK2，使其磷酸化[46-47]，同时也会磷酸化下游的转录因子AREB/ABFs/NTL，最后使相关胁迫响应基因表达。SnRK2s也会激活其他响应因子来增强抗性。

图3 植物SnRK2s参与的主要调控途径

研究表明，I类SnRK2s可以通过磷酸化mRNA-decapping激活子VCS，调控mRNA的含量。东京大学分析鉴定出3个RAF激酶作用于I类SnRK2s上游，以此来参与植物在渗透调节下的生长，加深了对非依赖于ABA的渗透胁迫信号调控机制的认识[48]。同时也发现部分RAF激酶会受到ABA和渗透胁迫2个方面的影响[49]。

通过对绒毛白蜡进行转录组测序可以知道，在盐胁迫条件下，FvSnRK2基因的表达量显著增加，由此可以推测FvSnRK2是使绒毛白蜡具有较强抗盐性的关键基因。目前在绒毛白蜡抗盐胁迫研究中，发现3个SnRK2家族的相关基因，分别为FvSnRK2182、FvSnRK5271和FvSnRK748，其编码蛋白均为亲水性。通过对前2个基因的克隆和分析可知，FvSnRK2182基因全长为1773 bp，共编码363个氨基酸，FvSnRK5271基因全长1267 bp，编码了343个氨基酸[50]。通过将基因在拟南芥中异源表达显示基因过量表达的植株对盐胁迫具有更强的抗性，侧根数量明显增多，地上干鲜重、地下干鲜重、叶绿素含量、K+含量明显上升，而Na+含量明显降低。

（3）转录因子的表达。植物在响应非生物胁迫时，转录因子是植物中一类重要的调节因子，与结构基因不同，转录因子与逆境调控基因并不是一一对应的。研究人员已经在马铃薯、拟南芥等植物中发现了与植物耐逆性相关的MYB转录因子。目前已经克隆了绒毛白蜡的FvMYB1、FvMYB2基因，cDNA全长分别为1203和1201 bp。研究结果表明，FvMYB1的表达量具有组织差异性，茎中表达量最高，而FvMYB2没有组织差异性，在各组织中表达差异不显著。两者都在一定程度上受盐胁迫诱导表达，对植物增强自身抗盐性有一定作用，主要表现在增强保护酶活性、增加脯氨酸和叶绿素含量等方面[35]。

2.2.3 DNA甲基化 植物对非生物胁迫的响应还包括转录前表观遗传调控的参与，以此调控基因来编码相关蛋白质[51]。越来越多的研究表明，表观遗传机制在植物应答非生物胁迫时发挥着重要作用[52]，通过表观修饰会导致基因表达以及基因功能发生变化。一般来说甲基化程度高会造成基因表达量减少，相关研究表明将绒毛白蜡和水曲柳进行杂交得到的子代植株具有明显的杂种优势，通过比较杂交子代和亲本种内开放授粉植株，发现F1杂交种在抗盐胁迫方面有了明显提高。研究表明F1杂交种的DNA甲基化程度低于亲本种内开放授粉植株的甲基化程度，且随着盐胁迫时间的增加，杂交种和种内授粉植株的DNA甲基化程度都增加，表明胁迫会使植物生长过程中DNA甲基化修饰程度提高，盐胁迫与DNA甲基化有关，并且会改变甲基化的模式[53]。

3 展望

通常所说的盐碱胁迫是盐化和碱化混合，人们经常将盐碱混为一谈，其实很多研究表明，盐胁迫和碱胁迫并不相同，是2种非生物胁迫类型[54]。2种胁迫对植物的伤害不同，盐胁迫一般会引起离子胁迫和氧化损伤，而碱胁迫除了造成上述伤害外，还会引起高pH胁迫[55]。响应盐胁迫和碱胁迫的分子机制会有共同点，也会有不同[56]。目前对于碱胁迫对植物的影响已经有了一些研究，但相对盐胁迫来说要少得多。对于绒毛白蜡在碱性胁迫下的反应，已经有了相关研究，实验证明碱性盐胁迫下脯氨酸的变化与中性盐胁迫不同，并且叶片中POD、SOD、CAT的变化比较复杂，并不成单一的变化趋势，这与中性盐胁迫不相同，其原因还有待进一步研究[17]。

植物一般具有交叉适应性。交叉适应性指植物遭受某一种逆境，启动一种自我调控机制时，同时也会提高对另一种逆境的抵抗能力。目前对于植物应对单一胁迫的研究已取得大量进展，而植物在自然界中遭遇的不良条件通常是几种胁迫同时存在，因此对植物响应联合胁迫的机制研究已成为重点方向[57]。因此各胁迫之间以及各调控机制之间会存在交叉重叠。干旱通常会造成渗透胁迫，而盐分则会造成渗透胁迫和离子毒害2个方面的影响，因此干旱胁迫和盐胁迫有一些重叠信号。已对一些物种进行过旱盐胁迫的研究，例如文冠果、沙枣、灰胡杨等。对绒毛白蜡的耐盐碱性可以集中于同时发生多种胁迫时的调控机制，以及生物胁迫和非生物胁迫信号之间的交互作用上。

目前对植物盐胁迫的研究实验大多在培养的无菌苗上进行，然而在自然环境中，植物是与微生物等共同生存的，今后的研究也可集中在了解相关微生物对植物抗性的影响上，有利于更加系统和完整地了解植物响应非生物胁迫的机制。