假禾谷镰孢菌产孢条件研究

陆宁海，张 强,杨 蕊，霍云凤，郎剑锋，石明旺，陈锡岭

(河南科技学院资源与环境学院植保系，新乡河南 453003)

小麦茎基腐病(wheat crown rot)最早于1951年由澳大利亚昆士兰州的Knight记载，该病害在澳大利亚的所有麦类种植区均有报道[1]。目前，茎基腐病已成为一种全球性的重要病害，在美国的西北太平洋区、南非、意大利、埃及和叙利亚、土耳其、西亚、南非和加拿大西部已发生[2]。在澳大利亚，茎基腐病造成小麦产量损失高达89%[3]。据调查，在澳大利亚，小麦茎基腐病造成减产所导致的直接经济损失每年约为7 900万澳元，间接损失大约为4.34亿澳元[4-5]。

近几年，茎基腐病在中国黄淮小麦主产区的河南、河北、山东、安徽、江苏等省普遍发生；河南省焦作、许昌、商丘、新乡等地部分麦田发生严重，而且呈现不断加重和蔓延趋势[6-10]。据本课题组调查，在河南省的部分地区，茎基腐病造成小麦减产达30%～50%。茎基腐病除了造成小麦产量损失外，还产生毒素，受害小麦作为食物或用作饲料，对人和牲畜的健康有极大威胁。本课题组前期研究表明，假禾谷镰孢菌是引起河南豫北地区小麦茎基腐病的主要病原菌。有关该病害的致病机理、寄主抗性、病原检测、遗传变异等基础研究需要大量的分生孢子作为材料，但假禾谷镰孢菌在常规条件下培养时，产孢量偏少。本研究拟对假禾谷镰孢菌的产孢条件进行初探，以期为小麦茎基腐病的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试病菌

假禾谷镰孢菌(F.pseudograminearum)菌株由本课题组分离、鉴定、保存。

1.2 测定项目与方法

1.2.1 产孢量的测定[11]

供试菌株活化7 d后，用直径4 mm的打孔器在距离培养皿中心位置打取菌饼，接入到实验设计平板的相同位置，置于实验设计的培养条件下；培养10 d后，用直径10 mm的打孔器打取4个菌饼置于10 mL的试管里，再加入1 mL的无菌水，在混均器上快速震荡10 min，使孢子充分洗脱下来，然后镜检并计数。

1.2.2 最佳培养基的确定[12-14]

移取1.2.1中直径4 mm的活化菌饼，分别接种于以下不同培养基上，于25 ℃培养10 d后测产孢量，每个处理重复三次。培养基种类如下：

(1)PDA培养基：马铃薯 200 g,葡萄糖 20 g，琼胶17 g，水1 000 mL。

(2)PSA培养基：马铃薯 200 g,蔗糖 20 g，琼胶17 g，水1 000 mL。

(3)燕麦片琼胶培养基： 燕麦片30 g，琼胶17～20 g，水1 000 mL。

(4)玉米粉琼胶培养基： 玉米粉 300 g，琼胶17 g，水1 000 mL。

(5)理查固体培养基(Richard)： 硝酸钠 10 g，磷酸二氢钾5 g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)2.5 g，氯化铁(FeCl3)0.02 g，蔗糖 50 g，琼胶 17 g，水1 000 mL。

(6)查彼固体培养基(Czapek)：硝酸钾2 g，磷酸氢二钾1 g，氯化钾0.5 g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5 g，硫酸亚铁(FeSO4) 0.01 g，蔗糖 30 g，琼胶17 g，水1 000 mL。

(7)SDA培养基：葡萄糖40.0 g，蛋白胨10.0 g，琼脂12.0～15.0 g，水1 000 mL。

(8)麦芽糖培养基：麦芽糖 25 g，琼胶17 g，水1 000 mL。

1.2.3 最佳碳源的确定[15]

基础培养基为：蔗糖20 g，硝酸钾5 g，磷酸钠2 g，硫酸镁1 g，琼脂12 g，蒸馏水1 000 mL。分别用等量的葡萄糖、甘露醇、果糖、麦芽糖与蔗糖置换，配成不同碳源培养基，按照1.2.1方法于25 ℃培养10 d后测产孢量。

1.2.4 最佳氮源的确定[16]

基础培养基同1.2.3，分别用等量的蛋白胨、氯化铵、尿素、硫酸铵与其中的硝酸钾置换，配置成不同氮源的培养基，按照1.2.1方法于25 ℃培养10 d后测产孢量。

1.2.5 最佳光照方式的确定[17]

移取1.2.1中直径4 mm的活化菌饼，接种于PDA平板上，25 ℃下分别置于24 h连续光照、24 h连续黑暗、12 h光照与12 h黑暗交替，培养10 d后测量产孢量。

1.2.6 最佳培养温度的确定[18]

移取1.2.1中直径4 mm的活化菌饼，接种于PDA平板上，分别于15 ℃、20 ℃、25 ℃、 30 ℃、35 ℃培养10 d后测产孢量。

1.2.7 最佳pH值的确定[19]

用1% HCl(V/V)和1% NaOH(W/V)溶液将PDA培养基的pH值配成pH为3～11共9个梯度，将活化直径为4 mm的活化菌饼接种于不同pH值的PDA平板，25 ℃培养10 d后测定产孢量。

1.3 数据处理

用Excel 2003 整理数据，用Duncan’s进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对病原菌产孢量的影响

由表1可以看出，在不同的培养基上假禾谷镰孢菌的产孢量差异程度不同。PSA培养基和麦芽糖培养基上的分生孢子数量较多，分别为13.52×102和11.45×102个·cm-2，且显著高于其他处理。其次是燕麦片培养基和SDA培养基上的产孢量，分别为 9.75×102和9.61 ×102个·cm-2。玉米粉培养基上的产孢量为6.51×102个·cm-2。査理培养基和査彼培养基均不利于产孢，产孢量分别为 3.36×102和2.91 ×102个·cm-2，显著低于其他处理。 因此， PSA培养基和麦芽糖培养基为最佳培养基。

2.2 不同碳源对病原菌产孢量的影响

由表2可以看出，病原菌在以麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、果糖和甘露醇为碳源的条件下均能产孢，产孢量分别为15.61×102、8.76×102、5.28×102、2.34×102和1.46×102个·cm-2。不同处理间差异显著，最有利于病原菌产孢的碳源是麦芽糖，其次是葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露醇。故最佳碳源为麦芽糖。

2.3 不同氮源对病原菌产孢量的影响

由表3可知，病原菌以硫酸铵、氯化铵、尿素、硝酸钾和蛋白胨为氮源时均能产生孢子，其中以硫酸铵为氮源时的产孢量为13.31×102个·cm-2，显著高于其他处理；氯化铵和尿素次之，产孢量分别为7.68×102和6.31×102个·cm-2；硝酸钾和蛋白胨则不利于产孢，产孢量分别为2.32×102和2.14×102个·cm-2。因此，硫酸铵为最佳氮源。

表1 不同培养基对病原菌产孢量的影响Table 1 Effect of different medium on sporulation of Fusarium pseudograminearum

同列数据后不同字母表示处理间在0.05水平差异显著。下表同。

Different lower-case letters following data indicate significant difference among the treatments at 0.05 level. The same in tables 2-6.

表2 不同碳源对病原菌产孢量的影响Table 2 Effect of different carbon sources on sporulation of Fusarium pseudograminearum

表3 不同氮源对病原菌产孢量的影响Table 3 Effect of different nitrogen sources on sporulation of Fusariumpseudograminearum

表4 不同光照对病原菌产孢量的影响Table 4 Effect of different light conditions on sporulation of Fusarium pseudograminearum

2.4 不同光照对病原菌产孢量的影响

由表4可知，病原菌产孢量在12 h光照和12 h黑暗交替条件下达到15.8×102个·cm-2，显著高于其他处理，24 h连续光照和24 h连续黑暗条件下产孢量较低，分别为2.71×102和1.7×102个·cm-2。因此，最佳光照条件为12 h光照和12 h黑暗交替。

2.5 不同温度对病原菌产孢量的影响

由表5可以看出，产孢量随着温度的升高而先升后降， 25 ℃时病原菌产孢量最大，为13.31×102个·cm-2，15～25 ℃处理间差异不显著；温度达到30 ℃时，病原菌产孢量急剧减少。因此，最佳培养温度为25 ℃。

2.6 不同pH值对病原菌产孢量的影响

由表6可知，随pH值升高，病原菌产孢量呈先增后减之势，当pH值为8和9 时，产孢量分别为12.36×102和12.58×102个·cm-2，且显著高于其他处理；随pH值的继续增大，产孢量逐渐减少。因此，最佳培养pH值为9～8。

表5 不同温度对病原菌产孢量的影响Table 5 Effect of different temperatures on the sporulation of Fusarium pseudograminearum

表6 不同pH值对病原菌产孢量的影响Table 6 Effect of different pH on the sporulation of Fusarium pseudograminearum

3 讨 论

国内外学者对小麦茎基腐病的病原进行了大量研究， 但结果差异较大。Fernandez等[20]和Jefferson等[21]从加拿大小麦地下组织中分离得到木贼镰孢菌(F.equiseti)、锐顶镰孢菌(F.acumiuatum)、尖孢镰孢菌(F.oxysporum)和燕麦镰孢菌(F.aveuaceum)，但致病力均不高。其他学者在西北太平洋地区分离获得根腐离蠕孢(Bipolarissorokiuiaua)、黄色镰孢菌(F.culmorum)、假禾谷镰孢菌(F.pseudograminearum)、燕麦镰孢菌(F.aveuaceum)和雪霉叶枯菌(Microdochiumnivale)，其中黄色镰孢菌和假禾谷镰孢菌对小麦的危害最大[22-25]。陈厚德等[26]认为，小麦茎基腐病的病原菌以镰孢菌属(Fusarium)种类为主，交链孢属(Alternaria)次之，而且镰孢菌属(Fusarium)种类致病力较强。李 伟等[27]研究认为，小麦茎基腐病的病原菌主要种类是镰孢菌(Fusarium)、根腐离蠕孢(B.sorokiuiaua)和雪霉叶枯菌(M.nivale)。综合国内外学者研究，禾谷镰孢菌(F.gramiuearum)、假禾谷镰孢菌(F.pseudograminearum)和黄色镰孢菌(F.culmorum)是大部分小麦种植区小麦茎基腐病主要病原菌种类，其中，假禾谷镰孢菌是该病害的主要病原菌，如在美国太平洋西北地区，南非，澳大利亚昆士兰州和新南威尔士州北部、阿根廷、意大利、埃及和叙利亚、土耳其、西亚和北非及加拿大西部等均有该病原菌被发现[28-30]。

假禾谷镰孢菌引起的小麦茎基腐病危害严重，亟待探索分析该病原菌的成灾机理、致病机制和寄主抗病性等问题，但是在常规培养条件下，病原菌不易产生孢子或孢子的数量太少,限制了研究工作的快速开展。因此，优化病原菌的产孢条件具有重要理论意义。

本试验结果表明，假禾谷镰孢菌在12 h光暗交替条件下产孢量显著高于连续光照和连续黑暗条件下产孢量，最佳培养碳源、氮源、温度、pH为麦芽糖、硫酸铵、25 ℃、8～9。