燕麦孢囊线虫生防真菌TL16发酵条件优化

李军平，卢智琴，罗宁，倪春辉，李惠霞

（甘肃农业大学植物保护学院，甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃 兰州 730070）

燕麦是世界各地广泛种植的一种粮食、饲草和饲料兼用作物，属一年生禾本科，具有很高的营养价值和一定的保健作用［1］。近年来，燕麦的产量和品质因各种病害的发生受到了严重的影响，其中由燕麦孢囊线虫引起的孢囊线虫病是新发现的一种病害。其病原为燕麦孢囊线虫（Heterodera avenae），又名禾谷孢囊线虫，属于垫刃亚目（Tylenchina）异皮科（Heterode‐ridae）孢囊线虫属（Heterodera），主要为害小麦、燕麦、大麦、黑麦等多种禾谷类作物和牧草［2-4］，因最初在燕麦上发现而命名为燕麦孢囊线虫。目前该线虫已在世界5大洲40多个国家发生危害［5-7］，造成小麦产量损失23%~50%，严重时达73%~89%［8］。在我国16个省、自治区、直辖市的小麦田，均有燕麦孢囊线虫为害，可造成高达35%的产量损失［9］。甘肃和宁夏燕麦发病率分别为 68.7%［10］和 47.6%［11］。近年来，该病害在连作田的发生呈逐年加重趋势，给小麦和燕麦生产造成重大威胁。

孢囊线虫病属于典型的土传病害，一旦传入，很难防治。目前，对燕麦孢囊线虫病的防治，主要采取利用抗病品种、轮作、化学药剂防治和种衣剂包衣等措施。我国现有小麦品种多为中度感病品种［12］，抗性材料缺乏。在一些地区，轮作等农业防治措施实施困难，生产中仍以化学防治为主。然而长期使用化学农药容易造成农药残留和环境污染，且植株易产生抗药性等。而生物防治对自然生态环境安全、无污染，能参与生态环境的调控，有利于保持生态平衡，使农田环境保持良性循环［13-14］。因此，利用微生物及其衍生物防治小麦孢囊线虫已成为目前的研究热点。

木霉菌（Trichodermaspp.）作为一种具有重要开发价值的生防因子，正逐渐被挖掘和利用［15］，目前已经成功应用于多种植物真菌及线虫病害的生物防治［16-18］。其中，张树武等［17］报道长枝木霉（Tricho⁃derma longibrachiatum）对燕麦孢囊线虫有较好的防治效果，李瑞等［19］报道长枝木霉菌株对南方根结线虫有较好的防治效果。本研究拟对长枝木霉菌株TL16固体发酵条件进行优化，以期推动燕麦孢囊线虫生物防治技术的应用。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试菌株：长枝木霉菌株TL16，由甘肃农业大学植物保护学院植物线虫学实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株活化和孢子悬浮液的制备 菌株TL16在 PDA培养基上，25 ℃下培养 7 d，加 1滴 Tween‐80和2 mL无菌水，摇匀后制取分生孢子悬浮液，将其浓度调整为5.0×107cfu/mL。

1.2.2 固体培养 将固体发酵培养基（固水比为1∶1）装入培养皿（d=9 mm），约15 g/皿，加入1 mL悬浮液，28 ℃黑暗培养7 d，3次重复。

1.2.3 产孢量的测定 在无菌条件下准确称取1 g带菌的培养基，在研钵中充分研磨，加99 mL水和一滴吐温80。搅拌后，振荡混匀用血球计数板统计孢子数，每处理重复3次，取其平均值。

产孢量（cfu/g）=80小方格内孢子个数/80×400×10 000×稀释倍数

1.2.4 固体发酵基质筛选 1） 单一基质筛选 以玉米秸秆粉、玉米芯、玉米粉、麦麸、花生壳和大豆秸秆等6种为单一基质进行固体发酵。然后选择产孢量高的3种基质，正交组合后进行下一步试验。

2）正交试验优化 采用正交试验因素水平（表1），将筛选出来的3种基质根据不同质量设置3个水平，设9个处理，根据孢子产生量选择较好的单一培养基质。

表1 正交试验L9（33）因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test L9（33）

1.2.5 碳源、氮源和无机盐的筛选 1） 碳源筛选在培养基质中，分别添加4%的乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、可溶性淀粉和葡萄糖，测定菌株TL16产孢量。

2） 氮源筛选 在培养基质中，分别添加4%的尿素、蛋白胨、硝酸钾、氯化铵、牛肉膏和硫酸铵，测定菌株TL16产孢量。

3） 无机盐筛选 在培养基质中，分别添加4%的氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、碳酸钙、硫酸铜和硫酸锰，测定菌株TL16产孢量。

运用正交试验，对不同添加量碳源、氮源和无机盐进行筛选，确定适宜于菌株TL16产孢的最佳组合。

1.2.5 固体发酵条件的优化 1） 温度 参照郭成等的方法［20］，根据 1.2.4试验结果，将发酵温度设 22、24、26、28、30、32、34和 36 ℃等 8个温度梯度，黑暗培养7 d，3次重复，筛选适宜菌株TL16产孢的最佳培养温度。

2） 含水量 上述试验条件下，将固体培养基与水的比例设为 1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.4和1∶1.6等7个处理，3次重复，其他培养及检测方法同上，筛选适宜菌株TL16产孢的最佳培养基含水量。

3） 接种量 在上述试验条件下，将接种量设为固料的1%、5%、10%、15%、20%、25%和30%等7个处理，重复3次。其他培养及检测方法同上，筛选适宜菌株TL16产孢的最佳接种量。

4） 发酵时间 上述试验条件下，在接种后4、5、6、7、8、9、10和 11 d，进行测定产孢量，确定菌株最佳发酵时间。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对菌株TL16产孢量的影响

菌株TL16在玉米粉、玉米秸秆粉、麦麸和花生壳基质上产孢量比较高。其中在麦麸上产孢量最高，为20.07×108cfu/g，且与其它处理差异显著（P<0.05）（图1）。因此，玉米粉、玉米秸秆粉、麦麸和花生壳基质4种基质确定为菌株TL16固体发酵的基础培养基。

图1 单一基质上菌株TL16的固体发酵产孢量Fig.1 Sporulation of strain TL16 in single matrix by solidstate fermentation

菌株TL16在麦麸+玉米粉固体培养基上产孢量最多，为8.93×109cfu/g，麦麸+玉米秸秆次之，产孢量为8.44×109cfu/g，且2个组合间无显著差异（P<0.05）。玉米秸秆+花生壳产孢量最少，与麦麸+玉米秸秆和麦麸+玉米粉组合产孢量有显著差异（P<0.05）（图2）。因此，培养菌株TL16的最佳组合是麦麸+玉米粉和麦麸+玉米秸秆。

图2 组合固体基质上菌株TL16的固体发酵产孢量Fig.2 Sporulation of strain TL16 in combined matrixes by solid-state fermentation

在总物料相等的条件下，培养7 d，菌株TL16在复合基质上的产孢量较单一基质均有不同程度的提升。根据R值，菌株TL16产孢量由多到少依次为麦麸、玉米粉和玉米秸秆，最佳发酵条件为A3B1C2，各组分含量分别为麦麸3 g、玉米粉1 g和玉米秸秆2 g，此时产孢量最多，为 10.64×109cfu/g（表2）。因此，菌株L16固体发酵培养基最佳配方组合为A3B1C2，即麦麸、玉米粉、玉米秸秆配比是3∶1∶2。

表2 复合基质上菌株TL16的固体发酵产孢量Tab.2 Sporulation of TL16 in different composite sub⁃strates by solid-state fermentation

2.2 不同碳源、氮源和无机盐固体发酵对产孢量的影响

菌株TL16在不同培养基上均能产孢，其中，以乳糖为碳源、蛋白胨为氮源和硫酸锰为无机盐的培养基上 产 孢 量 最 高 ，分 别 为 1.29×1010、1.58×1010和1.34×1010cfu/g，且均显著高于其它碳源、氮源和无机盐（表3）。因此，将乳糖、蛋白胨和硫酸锰确定为菌株TL16最适碳源、氮源和无机盐。

表3 不同碳源、氮源以及无机盐下的TL16固体发酵产孢量Tab.3 Sporulation of strain TL16 under carbon，nitrogen sources and inorganic salts by solid-state fermentation

当乳糖、蛋白胨和硫酸锰的添加量均为4%时，菌株产孢量最高，且与其他处理差异显著（P<0.05）（表4）。因此，将乳糖、蛋白胨及硫酸锰的添加量均确定为4%。

表4 菌株TL16固体发酵最佳碳源、氮源和无机盐添加量的筛选Tab.4 Screening of optimum carbon，nitrogen and inorganic salt additions for solid-state fermentation of strain TL16

正交试验结果表明，碳源、氮源和无机盐添对菌株TL16产孢量影响由高到低依次为：无机盐>碳源>氮源（表5）。经配比组合，TL16菌株在处理8（A1B2C3）中的产孢量最大，为1.59×1010cfu/g，即2%乳糖、4%蛋白胨和4%硫酸锰配比为产孢最佳的培养基组合。

表5 菌株TL16固体发酵最佳碳源、氮源以及无机盐最优组合的筛选Tab.5 Screening of the best combination of optimal carbon source，nitrogen source and inorganic saltfor for solid-state fermentation of strain TL16

2.3 菌株TL16固体发酵条件优化

2.3.1 温度对菌株TL16产孢量的影响 在22～36 ℃，菌株TL16均能产孢，28 ℃时产孢量最大，为1.68×1010cfu/g，显著高于其他处理（P<0.05）（图3）。因此，将菌株TL16最佳发酵温度确定为28 ℃。

图3 不同温度下菌株TL16的固体发酵产孢量Fig.3 Sporulation of strain TL16 under different tempera⁃tures by solid-state fermentation

2.3.2 含水量对菌株TL16产孢量的影响 菌株TL16在含水量不同的培养基上均能产孢，当固料∶水为 1∶1时，产孢量最大，为 1.60×1010cfu/g，且显著高于其他条件下的产孢量（P<0.05）（图4）。因此，菌株TL16最佳的固料∶水为1∶1。

图4 不同含水量下菌株TL16的固体发酵产孢量Fig.4 Sporulation of strain TL16 in different water content matrixes by solid-state fermentation

2.3.3 接种量对菌株TL16产孢量的影响 菌株TL16在接种量为15%、20%和25%时，产孢量比其他处理大，且差异显著（P<0.05），但三者之间不显著（P>0.05）（图5）。综合分析，将菌株TL16最佳接种量确定为15%。

图5 不同接种量下菌株TL16的固体发酵产孢量Fig.5 Sporulation of strain TL16 under different inoculum size by solid-state fermentation

2.3.4 发酵时间对菌株TL16产孢量的影响 菌株TL16第8天产孢量最佳，且与其他时段的产孢量差异显著（P<0.05）（图6），因此将菌株 TL16最佳发酵时间确定为8 d。

图6 不同发酵时间下TL16的固体发酵产孢量Fig.6 Sporulation of strain TL16 under different time by solid-state fermentation

3 讨论

利用生防真菌固体发酵物防治植物病害具有明显的优越性，因其成本低廉、操作简单、发酵产品便于运输和储存，因而被人们广泛使用［21］。罗洋等［22］发现木霉FS10‐C的最佳发酵基质为桔皮麦麸混合物，最佳发酵条件桔皮∶麦麸=1∶1，固水比 1∶1.2，接种量5%，28 ℃，发酵 11 d，产孢高达 2.13×1010cfu/g。鲁海菊等［23］研究表明深绿木霉P3.9生防菌株在最佳固体发酵基质和最佳培养条件下培养后产孢量最高达7.5×109cfu/g。朱海霞等［24］研究表明，在小麦粉和（NH4）2SO4作为碳源和氮源条件下固态发酵，生防菌株多孢木霉HZ‐31产孢量最多，达4.45×109cfu/mL，其产孢量是无碳、氮源的7.21倍。郝春英等［25］发现，生防链霉菌Men‐myco‐93‐63固体发酵基质为大米∶高粱∶米糠∶稻壳=2∶2∶3∶3（w/w），初始水料比为1.7∶1.0（v/w，不计稻壳质量），pH值6.2，固料添加量为30 g/L，接种量为7 mL，培养温度为28 ℃，发酵10 d时产孢量最大。以上研究结果表明，不同菌株固体发酵时，对基质、碳源、氮源、无机盐、温度和接种量等条件有不同的需求，因此，探寻适宜菌株自身生长的培养基和固体发酵条件很有必要。

本研究对菌株TL16固体发酵基质进行了筛选，发现当添加麦麸3 g、玉米粉1 g和玉米秸秆2 g，即麦麸：玉米粉：玉米秸秆粉为3∶1∶2时产孢量最多，为1.06×1010cfu/g。同时，对该菌株营养物质添加量进行筛选，发现菌株TL16发酵所需碳源、氮源和无机盐的配比为2%乳糖、4%蛋白胨和4%硫酸锰，产孢量最大为1.59×1010cfu/g。另外对发酵条件优化筛选发现，TL16菌株在最适条件下产孢量达到最大2.48×1010cfu/g。与景芳［26］、卢智琴［27］和罗洋［22］、鲁海菊［23］等研究结果相比较，基质配比相对复杂，但对菌株生长有利，用量少，且菌株产孢量高，所需的培养时间短。对于菌株TL16批量生产，上述发酵参数成本低且产出高，具有较大的应用潜力。目前，本试验只探讨了培养基组成，碳源、氮源、无机盐等在实验室小规模发酵对产孢量的影响，生产化的大规模发酵，及发酵物贮存期、货架期和有效期等试验尚未完成。菌株TL16进一步规模化生产和使用，除解决上述问题外，还需要评价田间施用效果、生防菌田间定殖特性和环境安全性等参数。

4 结论

菌株TL16最佳培养基基质为麦麸∶玉米粉∶玉米秸秆粉重量比为3∶1∶2，碳源、氮源和无机盐类型及添加量分别为乳糖2%、蛋白胨4%、硫酸锰4%，初始固料∶水为1∶1，发酵温度为28 ℃，接种量为15%，黑暗条件下发酵8 d。