GATA5抑制Ep CAM表达对肾癌HEK-293细胞系的影响

刘 诚石 嵩陈 文关建民

1.菏泽医学专科学校，山东菏泽 274000；2.菏泽市立医院，山东菏泽 274000

GATA5是调控器官发育的转录因子，含有2个典型锌指结构的DNA结合氨基酸序列（Cys-X2-Cys-X17-Cys-X2-Cys），胚胎时表达并调控内胚层调控来源 的器 官发 育［1−4］。研 究发 现 在消 化道 肿 瘤 中GATA5作为抑癌基因发挥抑制癌症进展的作用［5］；同样在肝癌中发现GATA5能抑制肝癌细胞生长，促进肝癌细胞凋亡［6］。EpCAM作为癌干细胞因子在癌形成和进展中发挥重要作用［7−10］。GATA5是否在肾癌中发挥相应的作用还是未知，GATA5与EpCAM是否存在作用关系同样未知，我们选取肾癌HEK-293细胞，通过构建pTT5-GATA5研究过表达GATA5后对HEK-293细胞生长调控作用及观察GATA5对EpCAM表达调控作用。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

将HEK-293细胞系（购自武汉细胞库）培养在含有10%胎牛血清和5%青霉素/链霉素DMEM培养基中培养。细胞在37℃并含5%二氧化碳的培养箱中培养［11］。

1.2 实验方法

1.2.1 表达载体的构建 通过NCBI：NM_080473.4获取GATA5的cDNA（从63号碱基到1256碱基）。我们在N端添加了KozaK序列GCCACC。限制性位点HindIII（5'-A^AGCTT-3'）和NotI（5'-GC^GGCCGC3'）。通过PCR仪扩增合成cDNA-GATA5。用HindIII和NotI限制酶（Takara Bio Inc.Inc）酶切PCR产物，并通过T4DNA连接酶（Takara Bio Inc.Inc）连接到相同酶切的表达载体pTT5-vector（Biovector，Inc.USA）中。将重组pTT5-GATA5标签载体转化到大肠杆菌（DH5-α）中用于扩增［12］。

1.2.2 构建表达载体验证 将构建好的pTT5-GATA5载体，用HindIII和NotII限制酶（Takara Bio Inc）按照说明书进行酶切后，通过1%琼脂糖凝胶电泳进行大小验证。

将构建好的pTT5-GATA5质粒送往天一辉远公司进行碱基测序，使用测序引物5'-GCCATACACTTGA GTGACAA-3'和5'-GGGATCTCGACCAAATGATT-3'。

1.2.3 细胞转染 待细胞长至80%状态时，用Lipofectamine 2000转染试剂参照说明书将pTT5-vector，pTT5-GATA5转入细胞中，参考实验方法［13］。

1.2.4 MTT检测细胞增殖 将HEK-293细胞（1.5×104个/孔）铺在96孔细胞培养板上，每孔补充含10%胎牛血清DMEM至500μl，培养12 h后，将培养基替换为不含胎牛血清的DMEM培养6 h，进行pTT5-vector、pTT5-GATA5质粒转染，每孔质粒用量为0.25μg，LipofectamineTM 2000用量0.5μl。转染24 h，48 h，72 h后，通过甲基噻唑基二苯基溴化四唑（MTT）测定细胞增殖。

1.2.5 细胞划痕实验 将HEK-293细胞（1.5×105个/孔）铺在6孔细胞培养板上，每孔补充含10%胎牛血清DMEM至500μl，培养12h后，将培养基替换为不含胎牛血清的DMEM培养6 h，进行pTT5-vector、pTT5-GATA5质粒转染，每孔质粒用量为0.25μg，LipofectamineTM 2000用量0.5μl。转染24h后进行细胞划痕实验，分别在24h，48h，72h进行观察记录。

1.2.6 实时定量反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）将HEK-293细胞（1.2×105个/孔）平铺于6孔板中，每孔质粒用量为1μg，LipofectamineTM 2000用量1.2μl。参考1.2.4进行细胞转染，分别培养24 h，48 h，72 h后收集细胞，通过RNA提取试剂盒提取总mRNA，通过RT-PCR试剂盒进行转录。

1.2.7 蛋白质免疫印迹（Western Blot）检测蛋白表达 将HEK-293细胞（1.2×105个/孔）平铺于6孔板中，每孔质粒用量为1μg，LipofectamineTM 2000用量1.2μl。参考1.2.4进行细胞转染，分别培养24 h，48 h，72 h后收集细胞，收集细胞提取总蛋白，通过Western Blot进行蛋白表达分析，一抗为GAPDH（鼠抗1∶1500）、GATA5（兔抗1∶1500）、EpCAM（兔抗1∶1500），4℃过夜；二抗为带有辣根脱氧化物酶的山羊抗兔（鼠抗1∶1500）、山羊抗鼠（鼠抗1∶1500），室温2 h。具体实验步骤参考文献［14］。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。以均数±标准差（xˉ±s）表示，两样本间比较采用t检验，以P≤0.05为差异有统计学意义［16］。

2 结 果

2.1 表达载体的构建及其验证

将带有酶切位点的GATA5基因片段和pTT5-vector质粒经过酶切、重新聚合和提纯后得到构建好的pTT5-GATA5质粒后（图1.A所示），将构建好的表达载体pTT5-GATA5质粒再次酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳验证相应目的基因和载体基因的位置准确性（图1.B所示），将构建好的质粒进行测序后发现其具有完整的GATA5-cDNA碱基序列（图1.C所示）。每次实验至少重复三次。

2.2 GATA5蛋白在HEK-293细胞中表达

设计mRNA-GATA5的RTPCR引物，将pTT5-GATA5质粒转入HEK-293细胞培养48h后，通过RT-PCR实验检测发现GATA5的mRNA表达增高（图2），提示GATA5在HEK-293细胞中过表达成功。将pTT5-GATA5质粒转入HEK-293细胞48 h后，设计GATA5-mRNA引物，通过RT-PCR检测GATA5mRNA表达。每次实验至少重复三次。

2.3 GATA5抑制HEK-293细胞的生长

将pTT5-GATA5质粒转入HEK-293细胞中分别培养24h、48h、72 h后，通过MTT方法测定细胞增殖率，发现随着时间延长，GATA5对细胞增殖抑制逐渐明显（图3），表明GATA5具有抑制肾癌细胞HEK-293增殖的生物活性。每次实验至少重复三次。

2.4 在HEK-293细胞中GATA5抑制EpCAM表达

构建设计好EpCAM的RT-PCR引物，将pTT5-GATA5质粒转入HEK-293培养48 h后，发现EpCAM mRNA表达降低（图4.A），细胞划痕实验发现表达GATA5后可以抑制细胞划痕的愈合（图4.B）。提示GATA5在HEK-293细胞中可以抑制EpCAM表达。每次实验至少重复三次。

图1 表达载体的构建及其验证

图2 GATA5蛋白在HEK-293细胞中表达

3 ?讨 论

GATA5具有调控细胞基因重编程，诱导干细胞分化成功能细胞的功能［17-18］，在不同器官中也被证实可以抑制癌细胞生长［19-20］，但GATA5在肾癌中的作用机制尚不清楚。本次实验中，我们通过构建pTT5-GATA5质粒过表达GATA5后，发现GATA5可以抑制HEK-293细胞增殖，表明GATA5可能具有潜在抑制肾癌增殖的作用。我们发现肾癌细胞系HEK-293中细胞重编程因子EpCAM的表达减少，而EpCAM作为细胞重编程因子在癌症进展中促进癌细胞恶性转化及转移，同时也与干细胞形成密切相关［21］，细胞划痕实验表明，GATA5可以抑制细胞的划痕修复愈合，而细胞划痕愈合与EpCAM的表达密切相关，这提示GATA5可以通过抑制EpCAM的表达起到抑制肾癌细胞生长的作用。

图3 GATA5对HEK-293细胞的生长影响

图4 在HEK-293细胞中GATA5对EPCAM表达影响

综合上述，EpCAM可能是GATA5发挥抑癌作用的下游靶点，在肾癌发生过程中靶向激活表达GATA5可能成为肾癌生物治疗方法，本研究为深入研究GATA5参与抑癌分子通路提供了思路。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突