基于荧光PCR检验方法对食品中沙门氏菌检验的分析研究

孔庆岩，胥小荣，庞 婕，王艳英，苗育可

（承德市食品药品检验检测中心，河北承德 067000）

食品安全是当今社会非常关注的话题，而食品安全多是由于食源性致病菌所致，沙门氏菌是近年来食源性致病菌最主要原因之一，所以快速有效的检测方法有利于减少食品安全的事件的发生。荧光PCR法检测致病菌病源，以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快和全封闭反应等优点而成为分子生物学研究中的重要工具[1-2]。传统的食品安全国家标准规定沙门氏菌的检验需要前增菌、二次增菌、平板分离、生化鉴定及血清学分析等步骤，培养时间长，出具实验结果需要至少5 d时间。其他如以抗原-抗体反应为基础的检测方法，如免疫酶实验、免疫扩散法、乳胶凝集实验、免疫荧光法及酶联免疫吸附试验等，使得沙门菌的检测受到一些限制[3]。因此，快速、准确、高效的检测方法是大势所趋，对快速及时发现致病菌，控制污染起到积极作用。目前最成熟的技术就是实时定量PCR检测致病菌病源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

检验食品：熟肉制品、糕点和餐饮常见食品等。沙门氏阳性菌标准菌株：乙型副伤寒沙门氏菌；非沙门菌阳性标准菌株：金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和大肠埃希氏菌O157:H7；细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN）；旋达R1致病菌生物检测系列“沙门氏菌核酸检验试剂盒”（双螺旋基因公司）。

1.2 仪器与设备

实时荧光定量PCR仪（CFX96TMOptics Moduie，BIORAD）；高速离心机（HC-1016，安徽中科中佳科学仪器有限公司）；生物安全柜（SC1100ⅡB2-X，生济南鑫贝西生物技术有限公司）

1.3 实验方法

1.3.1 DNA制备

（1）标准菌株。①取沙门氏菌复壮菌液1 mL于1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心5 min，弃去上清液。②用PBS将沉淀的菌体洗涤2次，加入100 µL已灭菌超纯水中，于100 ℃水浴15 min。③-20 ℃放置30 min。④37 ℃解冻后，用离心机12 000 r/min离心5 min，取得的上清液为沙门氏菌的DNA。

（2）TIANGEN细菌基因组使用DNA提取试剂盒提取。具体操作步骤参照试剂盒说明书。

1.3.2 食品样品DNA提取

致病菌是活的生物物质，为了得到大量的可检测致病菌，可以取一定量食品在培养基中进行培养增菌。培养增菌还可以简化介质，减少复杂食品介质对PCR的抑制影响。①称取25 g（mL）样品加入到225 mL缓冲蛋白胨水BPW增菌液培养基中，36 ℃增菌培养18 h。②取出1 mL增菌培养后的样品于1.5 mL离心管中，4 000 r/min离心10 min。③将上清液用移液枪转移至新的1.5 mL离心管中，用离心机12 000 r/min离心5 min。④弃去上清液，用PBS悬浮菌体，离心洗涤2次。⑤提取细菌基因组DNA。

1.3.3 实时荧光定量PCR扩增

（1）添加模板。剪下所需测试数的已含有反应液的PCR管，放置在室温待解冻后，离心30 s后揭开封口膜，向每管反应液中分别加入5 μL模板，顺序为空白、阴性对照、待测样品模板、阳性对照。盖好配套的PCR管盖后，涡旋混匀30 s，离心1 min，立即进行PCR扩增反应。

（2）扩增反应。使用荧光定量PCR仪，荧光基团选择FAM，淬灭基团选择TAMRA。

（3）PCR反应条件。①预变性：95 ℃，10 min，1个循环。②扩增：95 ℃，15 s；60 ℃，45 s。40个循环。在60 ℃时收集荧光。荧光通道选择FAM。

1.3.4 结果判断

①检测样品Ct≥40.0，曲线为直线或轻微斜线，无“S”型扩增曲线，样品阴性，不含沙门氏菌。②检测样品Ct≤35.0，曲线为“S”型扩增曲线，样品阳性，含有沙门氏菌。③检测样品35.0＜Ct＜40.0，需进行一次重复实验。

为确保检验结果的准确性，在进行实际样品检测时，设立空白对照、阴性对照和阳性对照实验。实时荧光PCR反应体系，在检验区进行检测，检测结束后，根据扩增曲线盒Ct值判定结果。

2 结果与分析

对一株沙门氏菌和3株非沙门氏菌及30个食品样品，用建立的PCR反应体系和反应条件进行实时荧光定量PCR反应。由图1知，沙门氏菌的检测结果为阳性，而非沙门氏菌检测可知，结果为阴性，食品样本为阴性，PCR方法比较传统增菌培养方法更具时效性的优势，通过此次检验数据结果的比较，表明建立的实时荧光定量PCR检测技术具有良好的的灵敏性、时效性和特异性，PCR方法和传统方法对比检测结果见表1。

图1 沙门氏菌 PCR阳性曲线

表1 PCR方法和传统方法对比检测结果

3 结论与讨论

该方法采用BPW对目标菌沙门氏菌和3种非沙门氏菌进行增菌，按直接提取法提取DNA模板，提高了检测效率，节省检测费用，方法特异性强、灵敏度高，能满足食品微生物的快速检测。由于PCR实验中退火温度对结果影响较大，通过优化，最佳退火温度设置为60 ℃，在该条件下，5种菌均能扩增出清晰条带，沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7和金黄色葡萄球菌在多重PCR中能检测出[4-5]。

在沙门氏菌的快速检验中，实时荧光定量PCR技术占有重要地位。它已成为保障食品安全，鉴定相应食源性致病菌的有力工具，相对于传统检验方法，具有自动化程度高、污染性小、实时性和准确性等特点，大大提高了检测的效率，节省了检测的人力、物力和财力。随着研究的不断深入，该方法会得以发展和完善，在沙门氏菌的检测中发挥更大作用，但仍存在一定不足，PCR本身灵敏度高，操作过程中存在系统误差、环境污染等问题，如样品间的交叉污染、外源性污染等其他污染，造成结果会产生假阳性。由于此方法是对基因片段进行检测，无法自动识别活菌与死菌，要求前处理过程需要有效控制，样品、试剂本身和设备等条件会抑制PCR酶反应。