孔庆岩,胥小荣,庞 婕,王艳英,苗育可
(承德市食品药品检验检测中心,河北承德 067000)
食品安全是当今社会非常关注的话题,而食品安全多是由于食源性致病菌所致,沙门氏菌是近年来食源性致病菌最主要原因之一,所以快速有效的检测方法有利于减少食品安全的事件的发生。荧光PCR法检测致病菌病源,以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快和全封闭反应等优点而成为分子生物学研究中的重要工具[1-2]。传统的食品安全国家标准规定沙门氏菌的检验需要前增菌、二次增菌、平板分离、生化鉴定及血清学分析等步骤,培养时间长,出具实验结果需要至少5 d时间。其他如以抗原-抗体反应为基础的检测方法,如免疫酶实验、免疫扩散法、乳胶凝集实验、免疫荧光法及酶联免疫吸附试验等,使得沙门菌的检测受到一些限制[3]。因此,快速、准确、高效的检测方法是大势所趋,对快速及时发现致病菌,控制污染起到积极作用。目前最成熟的技术就是实时定量PCR检测致病菌病源。
检验食品:熟肉制品、糕点和餐饮常见食品等。沙门氏阳性菌标准菌株:乙型副伤寒沙门氏菌;非沙门菌阳性标准菌株:金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和大肠埃希氏菌O157:H7;细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN);旋达R1致病菌生物检测系列“沙门氏菌核酸检验试剂盒”(双螺旋基因公司)。
实时荧光定量PCR仪(CFX96TMOptics Moduie,BIORAD);高速离心机(HC-1016,安徽中科中佳科学仪器有限公司);生物安全柜(SC1100ⅡB2-X,生济南鑫贝西生物技术有限公司)
1.3.1 DNA制备
(1)标准菌株。①取沙门氏菌复壮菌液1 mL于1.5 mL离心管中,12 000 r/min离心5 min,弃去上清液。②用PBS将沉淀的菌体洗涤2次,加入100 µL已灭菌超纯水中,于100 ℃水浴15 min。③-20 ℃放置30 min。④37 ℃解冻后,用离心机12 000 r/min离心5 min,取得的上清液为沙门氏菌的DNA。
(2)TIANGEN细菌基因组使用DNA提取试剂盒提取。具体操作步骤参照试剂盒说明书。
1.3.2 食品样品DNA提取
致病菌是活的生物物质,为了得到大量的可检测致病菌,可以取一定量食品在培养基中进行培养增菌。培养增菌还可以简化介质,减少复杂食品介质对PCR的抑制影响。①称取25 g(mL)样品加入到225 mL缓冲蛋白胨水BPW增菌液培养基中,36 ℃增菌培养18 h。②取出1 mL增菌培养后的样品于1.5 mL离心管中,4 000 r/min离心10 min。③将上清液用移液枪转移至新的1.5 mL离心管中,用离心机12 000 r/min离心5 min。④弃去上清液,用PBS悬浮菌体,离心洗涤2次。⑤提取细菌基因组DNA。
1.3.3 实时荧光定量PCR扩增
(1)添加模板。剪下所需测试数的已含有反应液的PCR管,放置在室温待解冻后,离心30 s后揭开封口膜,向每管反应液中分别加入5 μL模板,顺序为空白、阴性对照、待测样品模板、阳性对照。盖好配套的PCR管盖后,涡旋混匀30 s,离心1 min,立即进行PCR扩增反应。
(2)扩增反应。使用荧光定量PCR仪,荧光基团选择FAM,淬灭基团选择TAMRA。
(3)PCR反应条件。①预变性:95 ℃,10 min,1个循环。②扩增:95 ℃,15 s;60 ℃,45 s。40个循环。在60 ℃时收集荧光。荧光通道选择FAM。
1.3.4 结果判断
①检测样品Ct≥40.0,曲线为直线或轻微斜线,无“S”型扩增曲线,样品阴性,不含沙门氏菌。②检测样品Ct≤35.0,曲线为“S”型扩增曲线,样品阳性,含有沙门氏菌。③检测样品35.0<Ct<40.0,需进行一次重复实验。
为确保检验结果的准确性,在进行实际样品检测时,设立空白对照、阴性对照和阳性对照实验。实时荧光PCR反应体系,在检验区进行检测,检测结束后,根据扩增曲线盒Ct值判定结果。
对一株沙门氏菌和3株非沙门氏菌及30个食品样品,用建立的PCR反应体系和反应条件进行实时荧光定量PCR反应。由图1知,沙门氏菌的检测结果为阳性,而非沙门氏菌检测可知,结果为阴性,食品样本为阴性,PCR方法比较传统增菌培养方法更具时效性的优势,通过此次检验数据结果的比较,表明建立的实时荧光定量PCR检测技术具有良好的的灵敏性、时效性和特异性,PCR方法和传统方法对比检测结果见表1。
图1 沙门氏菌 PCR阳性曲线
表1 PCR方法和传统方法对比检测结果
该方法采用BPW对目标菌沙门氏菌和3种非沙门氏菌进行增菌,按直接提取法提取DNA模板,提高了检测效率,节省检测费用,方法特异性强、灵敏度高,能满足食品微生物的快速检测。由于PCR实验中退火温度对结果影响较大,通过优化,最佳退火温度设置为60 ℃,在该条件下,5种菌均能扩增出清晰条带,沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7和金黄色葡萄球菌在多重PCR中能检测出[4-5]。
在沙门氏菌的快速检验中,实时荧光定量PCR技术占有重要地位。它已成为保障食品安全,鉴定相应食源性致病菌的有力工具,相对于传统检验方法,具有自动化程度高、污染性小、实时性和准确性等特点,大大提高了检测的效率,节省了检测的人力、物力和财力。随着研究的不断深入,该方法会得以发展和完善,在沙门氏菌的检测中发挥更大作用,但仍存在一定不足,PCR本身灵敏度高,操作过程中存在系统误差、环境污染等问题,如样品间的交叉污染、外源性污染等其他污染,造成结果会产生假阳性。由于此方法是对基因片段进行检测,无法自动识别活菌与死菌,要求前处理过程需要有效控制,样品、试剂本身和设备等条件会抑制PCR酶反应。