应用于大视场生物成像分析仪的离轴三反显微物镜设计

刘广兴，张 洋，朱海龙，尹焕才，唐玉国1, *

（1.中国科学技术大学生物医学工程学院，安徽合肥230026；2. 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，江苏 苏州 215163）

1 引 言

随着社会的进步和科技的不断发展，在生命科学、食品药品检测、环境安全等领域中，都有从大量待测目标物中识别出少量/稀有（百万分之一）目标的需求，精准的检测结果是后续分析的前提。针对稀有细胞或痕量病原微生物的快速实时检测是最为典型的从大样本中检测极少目标物的代表，如果可以有效解决该问题将对癌症的早期诊断治疗和预防提供可靠且便捷的监控，也可为其他重大疾病的早期诊断和治疗提供有力监测手段，此外，还可以为保证食品、药品、空气等的质量与安全提供有效工具[1]。

目前针对稀有细胞或痕量病原微生物检测的方法主要有直接计数法、显微荧光计数法和流式细胞术等。直接计数法计数准确，可靠性高且成本低，常用于细胞/细菌检测，但检测前需要进行细胞培养，以实现稀有细胞的增殖，使其达到可观测水平，其检测速度较慢，检测时长达48~72 h，不能满足一些特定的快速、实时的检测需求[2]。显微荧光计数法主要是筛选目标细胞表面的特异性抗原，并对其进行特异性荧光标记，然后将其置于荧光显微镜下观测，并手动计数。利用此方法进行检测时，显微镜单次观测区域较小，要实现对大量样本的检测，需要对目标物品进行多次不同视野的观测，导致检测时间较长。另外，由于高倍显微镜的景深较小，观测中会存在部分目标物离焦的现象，因此需要反复对焦，增加了人工计数的难度[3]。流式细胞术需要先对目标细胞进行预处理，制作单细胞悬浮液，然后进行具有特异性和化学定量关系的荧光染色，悬浮液中的细胞逐一通过流动室，利用激光作为激发光源，同时测定目标细胞所携带的荧光种类及相对强度，进而用于细胞分群、功能鉴定等[4]。流式细胞术具有速度快，多参数检测的优点，但其要求被测目标物浓度不低于102~103/mL数量级，检测限过高，用于稀有细胞（如CTC细胞）和痕量微生物检测时，其系统误差过大。综上所述，以上几种方法都存在着一定的局限性，因此，研制一种新型的大视场生物成像分析仪，在一定范围内实现大视场和高分辨率，提高稀有细胞和痕量病原微生物的检测速度和精度，具有重要的实际意义。

对于作为大视场生物成像分析仪的核心显微物镜部分，本文以同轴三反成像理论为基础，采用视场离轴的方式设计了一款光谱范围为350~1 100 nm、放大倍数β=−1，视场范围为150 mm×20 mm，相对孔径大于0.1的用于大视场生物成像分析的离轴三反显微物镜，模拟分析了该离轴三反显微物镜的成像质量，建立了大视场生物成像分析仪系统检出性能评价方法，最后使用该系统检测带有荧光标记的靶细胞，对大视场生物成像分析仪进行性能评价。

2 光学结构和系统参数

2.1 系统技术指标

样品前处理需要对7.5 ml全血进行红细胞裂解，剩余至少7.5×107个以上的白细胞和若干稀有细胞，白细胞的直径一般在10~15μm，若将这些细胞以单层的形式平铺在载片上，所需面积大于1.687 5×104mm2，为了不影响观测质量，白细胞不可能一一密排，以细胞密度覆盖率为75%计算，所需的载片面积应大于2.25×104mm2。由于CTCs细胞直径略大于白细胞直径，极限情况下，为保证清晰度，一个CTC细胞需占两个像素，因此像元要小于5μm，若要获得更高的清晰度，以一个CTC细胞占3个像素计算，所设计的离轴三反显微物镜的成像分辨率要小于3.5μm。因此，光学系统的设计指标应满足：成像视场≥150 mm×20 mm；成像分辨率≤3.5μm。

2.2 光学系统方案

对于如此大物面的物方视场，在设计上即可采用反射式系统实现，也可采用折射式系统实现。其中反射式系统一般包含同轴反射和离轴反射两种，可采用离轴三反光学结构实现大视场及高分辨成像[5]，折射式系统可在双高斯结构的基础上进行复杂化，从而实现大视场成像。由于反射式系统的光谱范围不受限制，因此，可以选用不同种类的荧光试剂，以用于不同细胞和痕量微生物检测，而折射式系统在宽光谱范围内，很难消除二级光谱，从而影响整个仪器的普遍适用性。同时反射式系统可以设计为对称共轭系统，可以消除系统的畸变像差，提高成像质量，而折射式系统的畸变则受到材料的限制，虽然畸变可以矫正到较小的程度，但不能实现系统零畸变。考虑到系统的光谱范围和畸变特性，所以本设计选择反射系统作为优选方案。

离轴三反射光学系统根据光路中是否存在中间像，可分为RUG型和COOK型，RUG型结构的光阑位于主镜处，离轴时采用光阑离轴方式，系统中间存在像面。COOK型结构的光阑设置在次镜处，离轴时采用视场离轴方式，系统不存在中间像面。由于COOK型离轴三反系统的光路结构具有一定的对称性，不但可以设计成近远心光路，还可以很好地矫正畸变。同时，由于COOK型结构的对称性，可以将主三镜设计成完全对称的结构，从而将三片式离轴三反射系统简化成两片式，从而能够减少装调时的调整自由度，降低装调难度[6-7]。

根据光学系统的参数要求，综合以上分析，本文最终选择COOK型离轴三反结构进行设计。

2.3 光学系统参数确定

根据技术指标要求，检测载片尺寸要求为150 mm×20 mm，检测精度需达到3.5μm时，此时需要的单列最大像元总数为：

由于物面尺寸比较大，在保证放大率的同时还需控制成像焦面的尺寸，此时应尽量减小探测器像元的尺寸，但探测器像元尺寸太小时，耐奎斯特频率会很高，此时成像质量又难以保证，结合现有探测器技术水平，选用多片像元尺寸为3.1μm的CHR70MCMOS探测器拼接成像，所以此时像面尺寸为：

所以此时系统的放大倍数为

此CCD奈奎斯特频率为：

当系统需要达到3.5μm的分辨率时，根据瑞利判据

当主波长λ=0.56μm时，可得

考虑到物镜前大尺寸位移平台、滤光片模块等结构的安装空间，所以显微物镜的物象共轭距离不能太短，但如果显微物镜的物象工作距离过长，则会导致主镜、次镜和三镜口径过大，增加加工、检测及装调的难度。综合结构上的考虑，令显微物镜物象共轭距L=3 000 mm。根据公式：

f′=750 mm

则显微物镜焦距 ，所以光学系统的指标确定为：(1)设计波段：350~1 100 nm；(2)线视场：150 mm×20 mm；(3)数值孔径：0.1；(4)放大倍率：−1；(5)MTF@162 lp/mm：≥0.3；(6)物象共轭距：3 000 mm；(7)焦距：750 mm。

3 光学系统设计及像质分析

离轴三反系统一般是在同轴三反系统设计完成后采用孔径离轴、视场离轴方式进行离轴得到的，所以离轴三反系统的设计一般以求解同轴三反系统的初始结构为出发点[8]。图1为同轴三反系统的一般表示形式。M1、M2、M3分别表示主镜、次镜和三镜，它们的曲率半径分别为R1、R2和R3，其非球面系数分别为−e12、−e22、−e32，3个反射镜的间距分别为d1、d2，l2、l2′、l3和l3′分别表示次镜和三镜的物距和像距，系统的像方焦距为主镜的焦距为

图1 同轴三反结构图Fig.1 Coaxial three-mirror system

在初始结构求解时，首先将M2设置为孔径光阑，并令此时本系统将变为一个像方远心光学系统。然后，根据三反系统的平场条件，可推导出平场像方远心光学系统中R1、R2、R3、d1、d2、d3与系统焦距f′及次镜M2对主镜M1的遮拦比a1的关系式。再根据三级像差理论, 即可推导出平像场远心三反系统的三级球差SⅠ、彗差SⅡ和像散SⅢ与−e12、−e22、−e32和a1的关系式。然后令SⅠ、SⅡ、SⅢ为零，d1=|d2|，即可得到主三镜共面的同轴三反系统的初始结构[9-12]。

将得到的同轴三反系统的初始结构进行离轴优化，当离轴三反系统具有良好的成像质量时，再将无限远共轭系统的工作距慢慢调整为有限远。最终设计结果如表1所示，系统结构图如图2所示。

表1 光学系统的设计结构参数Tab.1 Configuration parameters of optical system

图2 系统结构示意图Fig.2 Schematic diagram of designed system

系统优化后的各个视场的调制传递函数（MTF）曲线如图3所示，各个视场的MTF值如表2所示。从图3和表2可以看出，优化后的系统在整个波段和视场范围内的成像质量都接近衍射极限，在Nyquist截止频率178 lp/mm处的MTF均值为0.357。光学系统的畸变图如图4所示。优化后离轴三反光学系统的畸变在全部视场下都为0%。系统的点列图如图5（彩图见期刊电子版）所示，各个视场的RMS值如表3所示。从图4和表3可以看出点列图RMS直径均值为3.56μm。图6为系统组装完成后的实际测试图，采用NBS 1963A分辨率测试板，由图6可知在144 lp/mm处，仍可分辨黑白条纹，由此可得系统实际分辨率约为3.5μm。

图5 系统点列图Fig.5 Systerm spot diagram

图6 分辨率测试图Fig.6 Resolution test

表 3系统各个视场RMS直径Tab.3 RMS spot sizes of the system with different field of views

图3 离轴三反系统MTF曲线Fig.3 MTF curves of coaxial three-mirror system

表2 系统各视场MTF值Tab.2 MTF values of the system with different field of views

图4 系统畸变图Fig.4 System distortion diagram

4 系统检出性能评价方法的建立

4.1 系统检出率

大视场生物成像分析仪光学系统需要在数十万个目标中精确识别出带有荧光标记的靶细胞，其检出率需大于95%，才能满足现有稀有细胞的检测需求。因此，拟采用与实际细胞尺寸一致的空白微球制作校准品，其中M个空白微球作为待测细胞，并且掺入N个荧光微球作为靶细胞，将其平铺在大视场载片上后，使用本系统进行检出率评价。具体判断标准如下：若本系统检出荧光微球G个，那么该系统的目标细胞检出率为G/N。

4.2 校准品制备

空白微球采用分散聚合与种子溶胀聚合相结合的方法，通过调整聚合单体、引发剂、分散剂等参数，实现低CV值的10μm粒径微球的合成，其孔径为30 nm，CV<5%。在此基础上，将量子点作为荧光染料，进一步制备荧光微球，具体流程如下：配置氯仿、正丙醇混合液作为反应溶液，体积比为9∶1；将量子点、微球按一定比例加入反应溶液，超声15 min，置于真空干燥箱干燥，至反应溶液完全挥发；挥发后的体系加入1 ml环己烷重悬并混匀，采用离心机以3 000 r/min 离心5 min，经过弃上清，留沉淀；重复上述操作2~3次后，干燥去除环己烷。干燥好的量子点微球中加入无水乙醇重悬待用。进一步对空白微球的形貌及荧光微球进行表征，具体结果如图7所示。

图7 (a)空白微球SEM表征及(b)荧光微球MERGE图Fig.7(a)SEMcharacterization of blank microspheres and(b)fluorescent microsphere MERGE diagram

通过对两种微球制备并表征后发现，制备的空白微球尺寸在10μm左右，符合细胞的尺寸需求。量子点荧光微球制备完成后并未改变微球的形态，荧光分布均一。本文制备的包含量子点的荧光微球的发射光谱分别为450，520，638 nm，满足大视场荧光检测的需求。进一步使用掺入实验在约10 000个空白微球中精确掺入100个荧光微球，使用系统检测荧光识别出的数量，用于评判系统检出率。该试验连续重复3次。

4.3 试验结果

将制作的样品以单层厚度铺片到面积为150 mm×200 mm的载玻片上，用大视场生物成像分析仪进行检测，对检出的荧光微球进行计数，试验装置和试验结果分别如图8、图9所示。该试验连续重复3次后发现，在共计10 100个微球中系统检出的荧光微球数平均为98个，故系统检出率为98%，达到了目标细胞检出率>95%的设计要 求。

图8 试验装置图Fig.8 Test device diagram

图9 试验结果Fig.9 Test results

5 结 论

本文利用离轴三反光学系统消像散技术设计了一种放大倍数为−1，视场范围为150 mm×20 mm，相对孔径大于0.1的大视场生物成像分析仪的显微物镜。在COOK式离轴三反光学结构的基础上设计了主三镜一体化式结构，使装调时的调整自由度减少，从而降低了装调难度。设计结果表明，该系统的分辨率可达3.5μm，在截止频率178 lp/mm处全视场的MTF均值为0.357，成像质量接近衍射极限，满足大视场生物成像分析仪的设计要求。在稀有细胞以及痕量病原微生物检测方面进行实验，结果表明其检出率达98%。本方法具有视场大、分辨率高、检测速度快等优点，对于稀有细胞和痕量病原微生物检测具有重要科学意义和实用价值。