槲皮素联合顺铂调控PI3K/Akt信号通路对肺癌A549/DDP细胞增殖与凋亡的影响

赵纯 管养洪 刘艳 张杰

肺癌是原发于气管、支气管和肺的恶性肿瘤，发病率、死亡率高，被称为“癌症头号杀手”[1]，患者中大约85%为非小细胞肺癌[2]。肺癌治疗方法有肺移植、化疗、放疗等，化疗是主要手段，但化疗药物容易产生耐药性且毒副作用大，严重影响治疗效果和患者的生存率[3]。槲皮素是一种多酚羟基化合物，具有较好的祛痰、止咳作用，并且还有一定的平喘作用。相关研究表明槲皮素具有抗癌、抗氧化、抗病毒、保护心血管、免疫调节等多种药理学活性[4,5]。顺铂是临床上非小细胞肺癌治疗的标准化疗药物，其抗癌的主要作用是造成DNA 损伤诱导癌细胞凋亡[6]。本次实验观察槲皮素联合顺铂作用对肺癌A549/DDP 细胞增殖、凋亡及磷脂酰肌醇-3-激酶（phasphatidy inositol-3 kinase，PI3K）/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（serine-threonine protein kinase，Akt）信号通路的影响，研究槲皮素与顺铂的协同作用，探讨其作用机制，为临床治疗非小细胞肺癌提供新的实验基础。

1 材料与方法

1.1 一般材料 本次实验时间为2020 年3 月至2020 年10 月，采用人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP（由湖南丰晖生物科技有限公司生产）进行实验研究，并选用槲皮素（由上海源叶生物科技有限公司生产）、顺铂（由上海脉铂医药科技有限公司生产）、CCK-8 检测试剂盒、JC-1 检测试剂盒（由上海碧云天生物公司生产）、凋亡检测试剂盒（由上海翊圣生物公司生产）、PI3K、Akt（由武汉三鹰生物技术有限公司生产）等材料。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组处理 实验分为槲皮素+顺铂组（槲皮素浓度160 μmol/L，顺铂浓度25 μmol/L）、顺铂组（浓度为25 μmol/L）、槲皮素组（浓度为160 μmol/L）和对照组（药物浓度为0）；其中各组二甲基亚矾（dimethyl sulfoxide，DMSO）浓度均控制在0.1%。

1.2.2 CCK-8 法检测细胞增殖抑制率 将不同浓度的槲皮素、顺铂单独及联合加入各孔，每个浓度梯度设4 个平行孔及药物空白孔（去除药物溶液自身颜色对测定的影响），并设添加0.1% DMSO完全培养基的对照组，等待48 h 后每孔加入20 μl CCK-8，细胞培养箱（由山东博科生物有限公司生产）内孵育2 h 后，于酶标仪（由上海聚慕医疗器械有限公司生产）450 nm 处测定吸光度值。计算各组细胞增殖抑制率。

1.2.3 Annexin V/PI 双染色流式细胞仪检测细胞凋亡率 实验分为槲皮素+顺铂组（0.1% DMSO、IC50槲皮素及IC50顺铂）、顺铂组（0.1% DMSO 及IC50顺铂）、槲皮素组（0.1% DMSO 及IC50槲皮素）、对照组（0.1% DMSO，药物浓度为0）。药物作用于细胞48 h 后，采集各组细胞，按照Annexin V-FITC 试剂盒（由上海翊圣生物公司生产）说明书进行操作步骤。计算各组细胞调亡率。

1.2.4 Western blot 检测蛋白的表达 细胞种板及药物分组与流式细胞仪检测凋亡率相同，药物作用48 h 后，按总蛋白提取试剂盒说明书提取各组总蛋白，用Bradford 法蛋白定量，经分离后，转膜，封闭，添加对应一抗，随后二抗孵育，TBST 洗涤，ECL 发光液加于PVDF 膜上，X 线胶片曝光，经显影、定影、扫描后观察结果。对扫描图像的目的条带进行灰度分析，目的条带与β-actin 的灰度比值即为目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（）表示。计量资料比较采用F检验和t检验；计数资料比较采用χ2检验。设P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组的细胞增殖抑制率和细胞凋亡率比较见表1

表1 各组的细胞增殖抑制率和细胞凋亡率比较/%

由表1可见，各组A549/DDP 细胞的细胞增殖抑制率和细胞凋亡率比较，差异均有统计学意义（F分别=12.26、163.10，P均＜0.05）。槲皮素组的细胞增殖抑制率和细胞凋亡率高于对照组（t分别=20.58、8.54，P均＜0.05）；顺铂组的细胞增殖抑制率和细胞凋亡率高于槲皮素组（t分别=2.17、6.32，P均＜0.05）；槲皮素+顺铂组的细胞增殖抑制率和细胞凋亡率高于顺铂组（t分别=2.54、5.78，P均＜0.05）。

2.2 p-PI3K、p-Akt蛋白的表达见表2

表2 各组的p-PI3K、p-Akt蛋白的表达比较

由表2可见，各组A549/DDP细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白表达水平比较，差异均有统计学意义（F分别=47.88、41.30，P均＜0.05）。槲皮素组的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白表达水平低于对照组，差异均有统计学意义（t分别=4.77、4.09，P均＜0.05）；顺铂组的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白表达水平低于槲皮素组，差异均有统计学意义（t分别=2.38、4.34，P均＜0.05）；槲皮素联合顺铂组的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白表达水平低于顺铂组，差异均有统计学意义（t分别=7.05、10.28，P均＜0.05）。

2.3 p-PI3K、p-Akt蛋白的表达结果见图1

由图1 可见，与对照组比较，槲皮素组p-PI3K、p-Akt 蛋白表达下降；与槲皮素组比较，顺铂组的p-PI3K、p-Akt 蛋白表达下降；与顺铂组比较，槲皮素+顺铂组p-PI3K、p-Akt蛋白表达下降。

图2 p-PI3K、p-Akt蛋白表达示意图

3 讨论

肺癌目前全球死亡率和发病率最高的恶性肿瘤，严重威胁人们的健康[7]。肺癌一般多发于中年以后的男性，近些年随着现代生活的发展，肺癌的发病率出现了年轻化趋势，而这种情况与不良生活习惯和环境污染有着较大的关系[8]。目前，世界上使用比较广泛的化疗药物是顺铂，它在肺癌的治疗过程中表现出较好的治疗效果，但长期应用会引起肿瘤细胞对其产生耐药性，导致治疗效果不佳，并且其毒副作用较大。因此，为了提高肺癌患者的临床治疗效果，寻找抵抗耐药性的新药非常重要[9]。相关研究表明，槲皮素是一种天然的黄酮类化合物，包括芸香苷和槲皮苷2 种糖基化形式，广泛分布于水果、蔬菜及多种中草药中，有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎以及保护心血管等功能。槲皮素还在多种恶性肿瘤中发挥抗癌活性，如乳腺癌、肝癌、肺癌、白血病等[10]。另外槲皮素还具有成本低和不良反应少的优点。相关研究表明，槲皮素可以减少顺铂引起的毒性反应[11]，增加顺铂化疗敏感性[12]。本次实验研究槲皮素联合顺铂对肺癌治疗的协同作用，并初步探讨其与PI3K/Akt信号通路之间的关系。

本次研究显示，槲皮素和顺铂单独使用时对肺癌A549/DDP细胞有增殖抑制作用，但槲皮素和顺铂联合应用后，对肺癌细胞的增殖抑制作用更加明显。本次实验结果显示，槲皮素联合顺铂使A549/DDP 细胞凋亡率明显上升。单用槲皮素或者顺铂也可使肺癌A549/DDP细胞凋亡率上升，但是槲皮素和顺铂联用后可明显诱导肺癌A549/DDP 细胞核破碎，且细胞早期凋亡率较槲皮素、顺铂单用组明显上升。刘强等[13]研究也证实，细胞凋亡在细胞生物体发育生长过程关键的作用，参与了多种生理病理过程，尤其是在癌症化疗治疗中为潜在的治疗策略。Western blot检测结果显示槲皮素与顺铂两药联用明显降低了p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达水平。

肺癌细胞的增殖、凋亡与PI3K/Akt 信号通路有关[14]。本次实验通过Western blot 实验发现，与对照组比较，单用槲皮素、顺铂组的p-PI3K/p-Akt 蛋白相对表达水平均较低，但随着槲皮素、顺铂联用，p-PI3K、p-Akt 蛋白相对表达水平均降低，这说明槲皮素联合顺铂可以调控p-PI3K、p-Akt 信号通路。这可能与Akt 是重要的PI3K 下游调节激酶之一有关。槲皮素联合顺铂通过抑制PI3K 的表达，使得PI3K 无法与Akt 的PH 区域含有苏氨酸和丝氨酸残基的底物磷酸化结合，抑制了Akt 的PH 区域含有苏氨酸和丝氨酸残基的底物磷酸化活化，Akt 发挥抗凋亡、促细胞生长的生物学效应主要通过对Akt 的PH 区域而实现。此过程活化被抑制使Akt 信号通路抑制细胞凋亡和促进细胞增殖均受到抑制，导致细胞趋向于凋亡。这与施银等[15]对PI3K/Akt 信号通路与细胞的增殖、凋亡及其与肿瘤的发生、发展的研究结果相类似。

综上所述，槲皮素联合顺铂抑制癌细胞的增殖并诱导其凋亡，其作用机制与PI3K/Akt 信号通路有密切关系，这为肺癌临床治疗提供了新的思路。同时也存在一些不足之处，细胞的体外实验与体内的情况不完全一致，还需通过动物模型甚至患者进行进一步深入研究，为将槲皮素联合顺铂应用于肺癌的临床治疗提供确切的理论依据。