响应面法优化黑果枸杞多糖的超声辅助提取工艺

唐 静,周艳红，崔建强，问娟娟

(陕西国际商贸学院 陕西省中药绿色制造技术协同创新中心，陕西 西安 712046)

黑果枸杞是药食两用经济植物，其成熟果实为紫黑色球形，味甜无毒。黑果枸杞果实中富含花青素、黄酮、多糖、蛋白质等多种化学成分，其中多糖是黑果枸杞的重要活性成分之一[1-2]。近代药理学研究发现，黑果枸杞多糖具有增强免疫力、延缓衰老、降脂、降压等功效，是一种重要的免疫调节剂[3-4]。天然产物中多糖的传统提取方法主要为水提醇沉法[3,5-6]，该法虽能得到一定纯度的多糖粗品，但是提取效率低、比较费时。因此，近些年研究者尝试采用超声、微波辅助及加酶来提高多糖的提取效率，以期开发更高效的提取方法[7-10]。

作者通过超声辅助浸提法对黑果枸杞多糖进行提取，以液料比、超声时间、超声温度和超声功率为考察因素，在单因素实验的基础上，采用响应面法优化黑果枸杞多糖的超声辅助提取工艺，为黑果枸杞多糖资源的进一步开发利用提供一定的理论依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

黑果枸杞，青海省格尔木。

葡萄糖，国药集团化学试剂有限公司；95%乙醇、浓硫酸，天津天力化学试剂有限公司；苯酚，天津北联精细化学品开发有限公司；实验用水均为蒸馏水。

智能台式电热恒温鼓风干燥箱，上海琅玕实验设备有限公司；FW-100D型高速万能粉碎机，天津鑫博仪器有限公司；BT-125D型电子分析天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；KQ-5200DE型数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循环水式多用真空泵，巩义予华仪器有限责任公司；DK-98-ⅡA型电热恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司；TU-1810PC型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 黑果枸杞多糖的提取

称取粉碎后的黑果枸杞粉5 g，加入蒸馏水浸泡1 h后超声辅助提取；将提取液浓缩后加入4倍体积的95%乙醇，醇沉12 h后挥醇干燥，即得黑果枸杞多糖。

1.3 葡萄糖标准曲线的绘制

精确称取100 mg葡萄糖，加蒸馏水溶解后移至100 mL容量瓶中，定容至刻度；再将其稀释，得到浓度(mg·mL-1)分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05的葡萄糖标准溶液，以水为空白，采用硫酸-苯酚法测定490 nm处吸光度。以葡萄糖浓度(c)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线(图1)，拟合得线性回归方程为A=13.22c+0.0668，相关系数R2=0.9991。

图1 葡萄糖的标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

1.4 黑果枸杞多糖的超声辅助提取工艺优化

1.4.1 单因素实验

分别考察液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，mL∶g，下同)、超声时间(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min)、超声温度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)、超声功率(120 W、140 W、160 W、180 W、200 W)对黑果枸杞多糖提取率的影响。

1.4.2 响应面实验

在单因素实验的基础上，以黑果枸杞多糖提取率为响应值，使用 Design-Expert 8.0.6软件进行数据分析，采用 BBD(Box-Behnken设计)方案做响应面优化，得到4因素3水平的优化模型，合计27组实验。响应面实验的因素与水平见表1。

表1 响应面实验的因素与水平

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 液料比对黑果枸杞多糖提取率的影响

在超声温度为70 ℃、超声时间为30 min、超声功率为160 W的条件下，考察液料比对黑果枸杞多糖提取率的影响，结果见图2。

图2 液料比对黑果枸杞多糖提取率的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of polysaccharides from Lycium ruthenicum Murr.

由图2可知，随着液料比的增大，即提取溶剂用量的增加，多糖提取率快速升高，当液料比为20∶1时，提取率达到最高；但进一步增加溶剂用量，多糖提取率略有下降。这可能是由于，随着溶剂用量的增加，自由水分子数目增多，溶解在水中的多糖增多；但溶剂用量过多时，会引入更多的杂质，导致多糖提取率下降。故，液料比以20∶1较为适宜。

2.1.2 超声时间对黑果枸杞多糖提取率的影响

在液料比为20∶1、超声温度为70 ℃、超声功率为160 W的条件下，考察超声时间对黑果枸杞多糖提取率的影响，结果见图3。

图3 超声时间对黑果枸杞多糖提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of polysaccharides from Lycium ruthenicum Murr.

由图3可知，随着超声时间的延长，多糖提取率逐渐升高，当超声时间为40 min时，提取率达到最高，为9.20%；随后继续延长超声时间，多糖提取率下降。故，超声时间以40 min较为适宜。

2.1.3 超声温度对黑果枸杞多糖提取率的影响

在液料比为20∶1、超声时间为40 min、超声功率为160 W的条件下，考察超声温度对黑果枸杞多糖提取率的影响，结果见图4。

图4 超声温度对黑果枸杞多糖提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of polysaccharides from Lycium ruthenicum Murr.

由图4可知，随着超声温度的升高，多糖提取率逐渐升高，70 ℃时达到最高。这可能是由于，黑果枸杞多糖在高温时结构被破坏，开始分解，继续升高超声温度，多糖提取率反而降低。故，超声温度以70 ℃较为适宜。

2.1.4 超声功率对黑果枸杞多糖提取率的影响

在液料比为20∶1、超声时间为40 min、超声温度为70 ℃的条件下，考察超声功率对黑果枸杞多糖提取率的影响，结果见图5。

图5 超声功率对黑果枸杞多糖提取率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic power on extraction rate of polysaccharides from Lycium ruthenicum Murr.

由图5可知，随着超声功率的增大，多糖提取率不断升高，在160 W时达到最高；继续增大超声功率，多糖提取率有所下降。这可能是由于，糖苷键在较大功率的超声作用下发生断裂，使黑果枸杞多糖结构发生破坏而导致多糖提取率下降。故，超声功率以160 W较为适宜。

2.2 响应面实验结果(表2)

表2 响应面实验设计与结果

对表2数据进行拟合，得二次多项回归模型方程为：Y=-106.18+2.14A+0.83B+0.75C+0.60D-0.014AB+0.035AC+0.017AD-0.021BC+0.026BD+0.062CD-0.052A2-0.005B2-0.006C2-0.002D2。

二次模型的方差分析结果见表3。

表3 二次模型的方差分析

2.3 响应面分析(图6)

由图6可知，各因素交互作用对黑果枸杞多糖提取率影响的响应面图均为一个向下的曲面，响应面曲线较陡，说明随着各因素取值的增大，各因素对黑果枸杞多糖提取率的影响先增大后减小，且各因素取值较小时影响较大。液料比与超声时间的响应面最陡，其对应的等高线图的椭圆形扁平程度也最大，说明液料比与超声时间的交互作用最明显。而AC、AD、BC、BD、CD交互作用等高线图的椭圆形扁平程度较小，尤其是BD和CD交互作用等高线图没有呈现明显的椭圆形，而是接近于圆形，说明其交互作用不明显，这与表3的分析结果一致。

图6 各因素交互作用对黑果枸杞多糖提取率影响的响应面图及等高线图Fig.6 Response surface map and contour map for effect of interaction between various factors on extraction rate of polysaccharides from Lycium ruthenicum Murr.

2.4 工艺验证

通过Design-Expert 8.0.6软件Box-Behnken设计优化得到超声辅助提取黑果枸杞多糖的最佳工艺条件为：液料比20∶1、超声时间40 min、超声温度60 ℃、超声功率180 W，多糖提取率预测值为9.26%(Std Dev=0.2178)。在此条件下进行3次验证实验，黑果枸杞多糖平均提取率为9.19%，与预测值相差0.07%，说明优化的提取工艺切实可行，适用于黑果枸杞多糖的提取。

3 结论

以液料比、超声时间、超声温度和超声功率为考察因素，在单因素实验的基础上，采用响应面法优化黑果枸杞多糖的超声辅助提取工艺。确定最佳提取工艺为：液料比20∶1(mL∶g)、超声时间40 min、超声温度60 ℃、超声功率180 W，在此条件下，黑果枸杞多糖的提取率为9.19%。