荧光定量PCR法与免疫组织化学法检测胃黏膜中幽门螺杆菌感染的临床意义

王晓楠（天津市东丽区东丽医院,天津 300300）

幽门螺杆菌（HP）属于革兰阴性螺旋杆菌，主要定植于胃黏膜上皮细胞表面，其感染与消化性溃疡、胃癌等发生密切相关[1-2]。免疫组织化学法（IHC）可在组织切片技术的基础上特异性结合抗体、抗原并通过组织化学显色技术原理实施检测，具有高敏感度和特异度，易于判断阳性，是诊断HP感染的常用手段[3]。荧光定量聚合酶链式反应（FQ-PCR）法具有敏感度高、特异度高等特点，还能定量分析病原体核酸，逐渐被应用于微生物感染[4]。本研究分析FQ-PCR法与IHC检测胃黏膜中HP感染的临床意义，为临床诊断方式选择提供参考。详情报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2019年8月-2020年12月我院接诊的86例慢性胃炎患者，均采集胃黏膜活检标本，其中女48例，男38例；年龄26-81岁，平均年龄（56.85±3.45）岁。

1.2 试剂与仪器 徕卡全自动免疫组织化学染色仪（LeicaBONDMAX型）；全自动荧光定量PCR仪（ABI7500型）；HP免疫组织化学检测试剂盒（Dako公司）；购自北京新基永康生物科技有限公司的HP23SrRNA基因突变核酸检测与HP分型鉴定试剂盒；购自中山大学达安基因股份有限公司的HP鉴定试剂盒；购自北京厚生博泰科技有限公司的DNA提取试剂盒。

1.3 方法

1.3.1 IHC检测HP 切取每例患者胃黏膜切片，厚度为4μm，设立阴阳性对照，使用全自动免疫组织化学染色仪染色。阳性判读标准：镜下胃黏膜黏液层、腺管上皮、小凹上皮、上皮表面存在着色为棕黄色的HP菌体。观察镜下胃黏膜黏液层、腺管上皮、小凹上皮、上皮表面HP判断感染强度。无：未见HP；轻度感染（+）：低于标本全长1/3或偶见有少数HP；中度感染（++）：HP分布超过标本全长1/3而低于2/3，或连续性、薄而稀疏地存在于上皮表面；重度感染（+++）：HP基本分布于标本全长，成堆存在。

1.3.2 FQ-PCR检测HP 切取每例患者石蜡组织切片10张，厚度为10μm，置入洁净的EP管内，用毛笔刷干净后，实施DNA提取。石蜡组织样本内加入缓冲液GA250μL，90℃环境下孵育60min，离心后，取200μL包含组织的液体，加入至新的EP管内，滴加蛋白酶K40μL，颠倒混匀，水浴，温度为56℃，过夜消化，待组织完全消化为准。离心处理消化后的液体，吸上清，加入新的EP管内，加入250μL缓冲液GB，震荡混匀后，水浴10min，温度为70℃。加入250μL无水乙醇，震荡混匀、离心。在DNA吸附柱内加入获取的混合液，放置1min，离心，将滤液去除。加入缓冲液GD500μL，放置1min，离心，将滤液去除。加入500μLPW，放置1min，离心，将滤液去除，重复两次。在新的收集管内套入吸附柱，离心后开盖，静置2min，使乙醇挥发。加入70℃预热后的Elution缓冲液50μL，静置2min，需Elution缓冲液在硅基质膜的中间悬空滴加，以确保洗脱液能完全覆盖硅基质膜。离心后获取样本DNA提取液。以每份TaqDNA聚合酶0.25μL、反应液22.5μL的标准分别配制分型、鉴定反应混合液，震荡混匀后，离心，按每管样本2.5μL、反应混合液22.5μL分装至PCR反应管中。最后加入阴性对照与阳性对照，离心，实施PCR扩增。调整阈值线，计算阈值（Ct值）。根据试剂盒说明书计算样本的ΔCt值，判读感染强度。轻度感染（+）：ΔCt值＞3.00；中度感染（++）：ΔCt值为0.01-3.00；重度感染（+++）：ΔCt值为0.00-0.01。

1.3.3 23SrRNA基因突变核酸检测 对IHC与FQ-PCR检测结果不一致样本实施HP23SrRNA基因突变核酸检测。前期操作与FQPCR检测相同，调整阈值线，计算Ct值。阳性感染：HP23S反应液1和2中存在VIC或FAM通道（23SrRNA反应液1中FAM通道、VIC通道分别为A2142G、AA野生型；反应液2中FAM通道、VIC通道分别为A2143G、AA野生型）且Ct值≤35.00。

1.4 观察指标 ①分析IHC与FQ-PCR检测胃黏膜标本中HP感染情况及其感染强度。②分析FQ-PCR检测胃黏膜标本中HP分型检测结果。

1.5 统计学方法 本次实验研究应用SPSS21.0软件分析数据，用（±s）表示计量资料，组间比较用t检验；以n（%）表示计数资料，组间比较用χ2检验，等级资料使用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HP感染情况 86份标本经FQ-PCR检测阳性率为30.23%（26/86），IHC检测阳性率为25.58%（22/86），两者检测HP阴性符合率为93.75%（60/64），阳性符合率为84.62%（22/26），总符合率为95.35%（82/86）。两种检查方式对HP阳性检出率比较，差异无统计学意义（χ2=0.462，P=0.497）。两种检查方式中共有4例不一致样本，均为FQ-PCR检测出而IHC未检出HP感染，对其实施HP23SrRNA基因突变核酸检测，结果显示均为阳性，可见存在HP感染。

2.2 HP感染强度 IHC与FQ-PCR检测胃黏膜标本中HP感染强度比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 HC与FQ-PCR检测胃黏膜标本中HP感染强度比较[n(%)]

2.3 HP分型检测结果 FQ-PCR检测胃黏膜标本中HP阳性标本26例，其中Ⅱ型菌4例（15.38%）。

3 讨论

HP感染后产生多种致病因子，对胃黏膜形成损害，诱发嗳气、反酸等症状，是引发胃腺癌、慢性胃炎等胃肠疾病发病的相关细菌感染[5]。HE染色、粪便HP抗原检测、尿素呼气试验等均是检测HP的常用手段，其中常规HE染色检测具有价廉、简便等优点，但菌体有着色差异，可能会发生染色较浅和无法与其他污染物或杂菌区分情况[6]。尿素呼气试验无创、操作简便，但需口服放射性同位素，可能会影响环境、人体，且不适用于胃轻瘫、胃下垂、幽门梗阻、晚期胃癌、高位梗阻、十二指肠瘀滞症等患者[7-8]。粪便HP抗原检测操作简便、无需口服任何试剂且无任何不良反应，为完全非侵入性检查，且无需昂贵仪器，但检查结果会受到试剂贮藏条件、运输和操作方法、操作人员技术等因素影响[9]。IHC检测准确性较高，但检测依赖于病理医师镜下观察经验与判读经验，检查结果会受到人为主观因素影响，且无法对HP做出分型判断。

本研究中，两种检查方式对HP阳性检出率、检测胃黏膜标本中HP感染强度均无明显差异；共有4例不一致样本，均为FQPCR检测出而IHC未检出的HP感染，对其实施HP23SrRNA基因突变核酸检测，结果显示均为阳性；FQ-PCR检测胃黏膜标本中HP阳性标本26例，其中Ⅱ型菌4例，提示IHC与FQ-PCR检测HP感染具有较高的符合率。FQ-PCR检测可靶向标记23SrRNA基因与16SrRNA基因，实行完全闭管式操作，避免扩增产物受到污染。FQ-PCR检测还能适时定量扩增产物，使反应精确度提高，结果可靠、操作简便，且能自动读数，进而避免发生人为误差[10]。FQ-PCR检测还具有取材方便、标本易于保存、检查耗时短等优点，适用于HP感染大规模筛查。

综上所述，IHC与FQ-PCR检测HP感染情况与感染强度符合率较高，FQ-PCR法还能检测HP基因分型，可将其作为在检测胃黏膜中HP时IHC法的替代检测法。