血管紧张素-（1-7）通过抑制活性氧激活的p38MAPK通路对抗阿霉素诱导的H9c2 心肌细胞损伤

孙玉会，刘旭丽

（上党区人民医院，山西 长治 047100）

0 引言

心肌病（CM）是一组由于心脏下部分腔室（即心室）的结构改变和心肌壁功能受损所导致心脏功能进行性障碍的病变。阿霉素（ADR 或DOX）是一种蒽环类抗肿瘤药物，因其对很多肿瘤均有较好的疗效，所以被广泛应用于临床。然而，其具有严重的心脏毒性[1-3]。p38MAPK 作为MAPK 家族中的一个重要成员，主要被环境应激及细胞因子激活，主要参与调节细胞的生长、分化、分裂以及死亡[4-5]。

血管紧张素-（1-7）[Ang-（1-7）]自1983 年在大鼠脑组织中被发现以来，从被认为是无活性的代谢片段到目前越来越多的生理及病理效应被发现，特别是在心血管系统的作用被许多学者重视[6]。本文应用DOX 损伤H9c2 心肌细胞，为深入阐明Ang-（1-7）的心肌保护作用提供新的实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

血管紧张素-（1-7）、N-acetyl-L-cysteine（NAC）、阿霉素、Hoechst 33258、双氯荧光素（DCFHDA）和罗丹明123（Rh123）购自Sigma Aldrich 公司（USA），细胞计数试剂盒8（CCK-8）由Dojindo Lab（日本）提供，蛋白预览Marker（10-170Kd）购自Fermenta 公司，DMEM-F12 培养基以及特级胎牛血清（FBS）购自Gibco BRL（USA），抗t-p38、p-p38抗体及SB302580（p38MAPK 抑制剂）购自Cell Signaling Technology Inc（CST）。

1.2 细胞培养和分组

H9c2 细胞来源于大鼠胚胎期心脏组织。在37 ℃、5%CO2的条件下，培养于含有10% 胎牛血清的DMEM-F12培养基中。

实验分为8 组：①正常对照组；②阿霉素损伤组；③血管紧张素-（1-7）预处理+阿霉素损伤组：10-3μmol/L Ang-（1-7）作用H9c2 心肌细胞2 h，撤去，用PBS 洗两2 次，接着5 μmol/L DOX 作用24 h；④SB203580 预处理+阿霉素损伤组：5 μmol/L SB203580 作用H9c2 心肌细胞60 min，撤去，用PBS 洗2 次，接着5 μmol/L DOX 作用24 h；⑤NAC 预处理+阿霉素损伤组：1000 μmol/L NAC 作用H9c2 心肌细胞60 min，撤去，用PBS 洗2 次，接着5 μmol/L DOX 作用24 h；⑥血管紧张素-（1-7）处理组：10-3 μmol/L Ang-（1-7）作用H9c2 心肌细胞2 h；⑦SB203580 处理组：5 μmol/L SB203580作用H9c2 心肌细胞60 min；⑧NAC 处理组：1000 μmol/L NAC 作用H9c2 心肌细胞60 min。

1.3 Western blot 测定p38MAPK 蛋白的表达

大鼠H9c2 心肌细胞接种于60 mm 培养皿中，各实验组给予不同的处理因素后，用预冷的PBS 洗3 次，加入细胞裂解液60 mL，4 ℃冰箱中静置30 min，12000 r/min 离心10 min，取上清，采用BCA 法进行蛋白定量。总蛋白经SDSPAGE 分离后，转移到PVDF 膜上。用5% 脱脂奶粉封闭90 min，随后加入抗p-p38MAPK 抗体（1:1000）、抗t-p38MAPK 抗体（1:1000），4 ℃冰箱中过夜，用TBST 洗3 次，10 min/ 次。将PVDF 膜用发光试剂ECL 显色，暗室曝光到X 线片上，凝胶成像系统扫描分析结果。

1.4 CCK-8 测定心肌细胞存活率

大鼠H9c2 心肌细胞接种于96 孔培养板中，当细胞生长到培养孔约80%面积时，根据实验需要进行不同的处理；每个处理因素设5 个复孔。终止培养后，每孔加入10 μl CCK-8，轻摇，37 ℃孵育2.5 h，用酶标仪（λ=450 nm）记录各孔的吸光度（OD）。取5 孔OD 值的平均数，按下列公式计算心肌细胞存活率：细胞存活率（%）=处理组OD/ 对照组OD×100%，重复3 次。

1.5 Hoechst33258 核染色法测定细胞凋亡

将大鼠H9c2 心肌细胞接种于24 孔培养板中，在细胞生长到占培养孔面积大约80%时，上述各实验组不同的处理因素后，弃去培养基，PBS 冲洗3 次，然后用4% 多聚甲醛于4 ℃环境中固定15 min，PBS 冲洗3 次，加入含5 mg/L Hoechst33258 试剂，于37 ℃温箱孵育15 min，然后用PBS冲洗3 次。在荧光显微镜下（TE-2000’ Nikon’ Japan）摄片，染色质呈均匀分布，核被染成均匀蓝色的细胞被认为是正常的心肌细胞，如细胞核呈浓缩、碎裂的明亮蓝色细胞则被认为是凋亡的心肌细胞，随机选取视野在荧光显微镜下摄片。重复3 次。

1.6 心肌细胞胞内ROS 水平的测定

细胞内的ROS 可将无荧光的DCFH 氧化成发出绿色荧光的DCF。绿色荧光的强弱可以间接反映细胞内ROS 的水平。将赖氨酸包被的盖玻片置于12 孔培养板内，H9c2 心肌细胞被均匀地接种于盖玻片上。当细胞生长到培养孔约80%面积时，根据实验需要给予相应的处理。每组均包括3个复孔。处理完成后，用PBS 漂洗盖玻片3 次，用10 μmol L-1DCFH-DA 染液于37 ℃孵育30 min。在荧光显微镜下随机选取5 个不重复区摄片，用Image J 1.47i 软件分析5 个视野绿色荧光强度的平均值，再对每组的各样本进行统计分析。

2 结果

2.1 Ang-（1-7）减弱DOX 对p38MAPK 表达的上调作用

单独10-3 μmol/L Ang-（1-7）处理心肌细胞2 h 对p-p38MAPK 的基础表达无明显的影响，见图1。

图1 Ang-（1-7）减弱DOX 对H9c2 心肌细胞p-p38MAPK 的上调作用

2.2 Ang-（1-7）、p38MAPK 通路抑制剂和NAC 拮抗DOX 引起的心肌细胞毒性

单独的10-3μmol/L Ang-（1-7）、5 μmol/L SB203580 或者1000 μmol/L NAC 作用H9c2 细胞对心肌细胞存活率无明显影响，见图2。

图2 Ang-（1-7）、p38MAPK 通路抑制剂和NAC 抑制DOX 引起的心肌细胞毒性

2.3 Ang-（1-7）、p38MAPK 通路抑制剂和NAC 减轻高糖引起的心肌细胞凋亡

Hoechst 33258 染色的结果（图3）显示，单独的10-3μmol/LAng-（1-7）、5 μmol/L SB203580 或 者1000 μmol/L NAC 作用H9c2 细胞本身不引起细胞凋亡。

图3 Ang-（1-7）、p38MAPK 通路抑制剂和NAC 减轻高糖引起的心肌细胞凋亡

3 讨论

阿霉素性心肌病是由于阿霉素诱导的心肌细胞损伤所致，心肌毒性是阿霉素危害最大，严重限制了阿霉素的临床应用，其中阿霉素诱导的心肌毒性主要机制有氧化应激和细胞凋亡，为了找到更特异和高效的防治措施，深入研究阿霉素引起心肌毒性的发病机制十分必要[7-8]。本研究结果显示，阿霉素可以激活p38MAPK，采用ROS 清除剂NAC 后可以抑制阿霉素诱发的p38MAPK 的磷酸化；这些实验数据提示：ROS 介导了阿霉素激活的p38MAPK 信号通路的激活。

综上所述，本文证实Ang-（1-7）能保护H9c2 心肌细胞对抗DOX 引起的心肌毒性，此保护作用可能与其对抗ROS激活的p38MAPK 通路从而发挥其抗氧化作用、线粒体保护及抗凋亡作用等有关。Ang-（1-7）是具有广泛生物学活性的内源性血管紧张素，具有显著的心肌保护作用，但其机制尚未明了，值得我们继续探索。