益气活血方对缺氧H9c2心肌细胞凋亡的影响*

吴鸿，高海霞，高水波，王新洲，韩丽华，王振涛

河南中医药大学第二附属医院／河南省中医院，河南 郑州 450002

益气活血方（yiqi huoxue decoction，YHD）是复方制剂，由黄芪、人参、赤芍、红花等药组成，临床广泛用于冠心病等心血管疾病的治疗［1］。前期研究发现，YHD具有抗血小板聚集［2－3］、抑制左室重构［4－5］、促进血管新生［6－7］等作用，提示YHD具有良好的心肌保护功能。研究发现，缺氧可诱导体外培养的心肌细胞发生凋亡［8－9］，抗凋亡蛋白Bcl－2表达下调，促凋亡蛋白Bax表达上调［10－11］，而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase－3）的激活被认为是细胞发生凋亡重要的标志［12－13］。YHD对缺氧心肌的保护作用是否涉及到细胞凋亡尚未见报道。本实验通过过氧化氢（H2O2）诱导体外培养大鼠H9c2心肌细胞发生凋亡，观察YHD对心肌细胞凋亡的影响。

1 材料

1.1 细胞大鼠心肌细胞H9c2购自中科院上海细胞库，批号：GNR 5。

1.2 药物与试剂YHD（由黄芪、人参、红花、赤芍组成，四川新绿色药业科技发展有限公司，批号：0029912783）；辛伐他汀（simvastation，ST）（美国Sigma公司，批号：S6196）。DMEM高糖培养基（以色列BI公司，批号：06－1055－57－1ACS）；胰蛋白酶（以色列BI公司，批号：03－050－1ACS）；胎牛血清（美国Gibco公司，批号：16000－044）；H2O2（美国Sigma公司，批号：88597）；四氮唑蓝（MTT）（美国Sigma公司，批号：N6876）；二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma公司，批号：D2650）；AnnexinV－FITC细胞凋亡检测试剂盒购自苏州碧云天生物技术有限公司（上海碧云天生物技术有限公司，批号：C1062M）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，P0012）；SDS－PAGE凝胶试剂盒（西安晶彩生物公司，批号：JC－PE022）；ECL发光液（西安晶彩生物公司，批号：JC－PC022）；Bcl－2抗体（武汉三鹰生物公司，批号：12789－1－AP）；Bax抗体（武汉三鹰生物公司，批号：50599－2－Ig）；Caspase－3抗体（武汉三鹰生物公司，批号：66470－2－Ig）；β－actin抗体（武汉三鹰生物公司，批号：66009－1－Ig）；羊抗鼠二抗（武汉三鹰生物公司，批号：SA00001－1）；羊抗兔二抗（武汉三鹰生物公司，批号：SA00001－2）。

1.3 仪器生物安全柜（美国赛默飞公司，型号：1384－A2）；二氧化碳培养箱（美国赛默飞公司，型号：3111）；酶标仪（美国赛默飞公司，型号：MULTISKAN FC）；SDS－PAGE凝胶系统（美国Bio－Rad公司，型号：Mini－PROTEAN）；半干转膜仪（美国Bio－Rad公司，型号：Trans－Blot SD）；Western blot成像系统（美国Bio－Rad公司，型号：ChemiDoc XRS＋）；Incu Cyte Zoom活细胞成像及分析系统（美国Essen Bio Science公司，型号：40733）。

2 方法

2.1 YHD的制备将YHD颗粒研磨至粉末状，实验前加PBS缓冲液，加热超声溶解，用0.22μm滤膜过滤后制成200 g·L－1YHD药液（相当于3 g生药·mL－1），4℃保存备用。

2.2 细胞培养及实验分组H9c2细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃含5%CO2培养箱中。将状态良好的H9c2细胞以每孔1×106个接种于6孔板中分为4组，并做如下干预：①空白对照组（Ctrl）：H9c2细胞正常培养；②模型组（H2O2）：H9c2细胞培养液中加H2O2（200μmol·L－1）作用6 h；③YHD组：H9c2细胞用YHD（0.75 g·L－1）培养16 h后加H2O2（200μmol·L－1）继续作用6 h；④ST组：H9c2细胞用ST（5μmol·L－1）培养16 h后加H2O2（200μmol·L－1）继续作用6 h。以下实验分组及药物干预同此方法，且每次实验重复3次。

2.3 MTT法测定H9c2细胞活力将H9c2细胞以每孔1×104个接种在96孔板中，每组3个复孔，经上述不同处理后，每孔加MTT液10μL（5 g·L－1），37℃继续培养4 h，吸除培养液，每孔加入150μL DMSO，振荡10 min，于490 nm波长检测各孔吸光度（A）值。对照组不加处理因素，细胞活力以100%计算；空白对照不加细胞，仅加相同体积细胞培养液。

细胞存活率＝（实验组A值－空白对照A值）／（对照组A值－空白对照A值）×100%

2.4 AnnexinV－FITC检测H9c2细胞凋亡率将各组H9c2细胞以每孔1×104个接种在96孔板中，按照方法2.2分为Ctrl组、H2O2组、YHD组及ST组，每组3个复孔，并做相应干预。干预结束后，吸除细胞培养液，PBS洗3次，每孔加入195μL AnnexinV－FITC结合液，5μL AnnexinV－FITC，轻轻混匀，再加入10μL碘化丙啶染液（PI），混匀，37℃避光孵育15 min，在实时荧光显微镜下观察，AnnexinV－FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

2.5 Western Blot法检测凋亡蛋白Bcl－2、Bax及Caspase－3蛋白表达将状态良好的H9c2细胞以每孔1×106个接种于6孔板中，按照方法2.2分为Ctrl组、H2O2组、YHD组及ST组，并做相应干预。干预结束后，收集各组H9c2细胞于1.5 mL EP管中，离心，弃上清，PBS洗3次，每管中加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，离心取上液，BCA法测蛋白浓度，用裂解液调整蛋白浓度，加蛋白loading buffer加热进行变性，每孔上样10μL。电泳，转膜，封闭，加入相应的一抗、二抗、ECL显色。采用Image Lab 3.0软件对免疫印迹图的灰度值分析。本实验重复3次。

2.6 统计学方法采用SPSS 20.0软件进行统计分析，结果数据用均数±标准差（±s）表示，组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，以P＜0.05为有统计学意义。

3 结果

3.1 对H 2 O2处理后H9c2细胞活力的影响与空白对照组比较，模型组H9c2细胞活力明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，YHD组与ST组H9c2细胞活力明显增加（P＜0.05）。提示YHD对缺氧诱导的细胞损伤有一定的保护作用。见图1。

图1 YHD对H2 O2处理后H9c2细胞活力的影响

3.2 对H 2O2诱导H9c2细胞凋亡的影响与空白对照组比较，模型组H9c2细胞间隙增大，细胞伪足收缩，细胞膜破裂。与空白对照组比较，模型组凋亡显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，YHD组及ST组凋亡明显减少（P＜0.05），见表1、图2。

表1 对H 2 O2诱导的H9c2细胞凋亡的影响 （x¯±s）

图2 对H 2 O2诱导H9c2细胞凋亡的影响

3.3 对H 2 O2诱导H9c2细胞Bcl－2、Bax及Caspase－3表达的影响与空白对照组比较，模型组H9c2细胞Bcl－2／Bax水平明显降低（P＜0.05），Caspase－3蛋白表达明显（P＜0.05）；与模型组比较，YHD组及ST组H9c2细胞Bcl－2／Bax水平明显升高（P＜0.05），Caspase－3蛋白表达明显下调（P＜0.05）。见图3。

图3 对H 2 O2诱导H9c2细胞Bcl－2、Bax及Caspase－3表达的影响

4 讨论

YHD是本研究团队治疗心血管疾病的经验方，临床上对于胸痹心痛气虚血瘀型患者有较好的治疗效果［1］。课题组前期研究发现，YHD具有抗炎［16－17］、抗血小板聚集［18－19］和促进血管新生［6－7］的作用。研究表明，方中黄芪、红花、人参、赤芍均具有抗氧化的作用［20－23］。本实验采用H2O2刺激H9c2心肌细胞，构建心肌细胞凋亡模型，以探究YHD抗氧化损伤的保护心肌作用。

心肌细胞缺血缺氧后，造成高水平氧化应激，进而引发细胞凋亡，导致心肌坏死，发生严重的心血管事件。细胞凋亡是由多种基因控制参与的主动过程，其中Bcl－2、Bax是重要的调控因子，当Bcl－2／Bax水平降低时，触发下游凋亡信号，激活Caspase－3。Caspase－3是细胞凋亡的主要执行者，引起DNA降解、细胞核碎裂等，最终导致细胞凋亡的发生［24］。研究表明，YHD提取物黄芪多糖可以提高缺血性心肌病患者心功能［25］，黄芪甲苷可以抑制心力衰竭大鼠心肌纤维化［26］；人参活性成分可以抑制糖尿病心肌病心肌细胞凋亡保护心脏功能［27］；红花提取物对病毒性心肌炎小鼠具有保护作用［28］。另外，YHD类似的益气活血中药可以抑制糖尿病心肌病大鼠心肌细胞凋亡［29］。以上研究结果表明，YHD提取物及类似组方具有抑制缺血性心肌病、病毒性心肌炎、糖尿病心肌病心肌细胞凋亡的保护作用。本研究用一定浓度（200μmol·L－1）的H2O2处理H9c2心肌细胞，得到心肌细胞凋亡模型。ST对缺氧诱导的细胞损伤有保护作用［14－15］，选用ST作为阳性对照组。

本研究发现，YHD能够对抗H2O2引起的H9c2心肌细胞活力降低，明显降低心肌细胞凋亡率。同时能明显升高Bcl－2／Bax水平，下调Caspase－3蛋白表达。因此，YHD预处理可明显抑制H2O2诱导的大鼠H9c2心肌细胞凋亡，今后将进一步来阐明YHD抗心肌细胞凋亡的作用机制。