斑蝥酸钠注射液靶向PI3K／AKT／mTOR信号通路对人肺腺癌细胞A549迁移能力的影响*

房传赐，钱亚云

扬州大学，江苏 扬州 225001

肺癌是临床常见的恶性肿瘤，在我国发病率与死亡率均居所有癌症首位［1］。早期肺癌多采用手术治疗的方式，但肺癌的高转移性与高侵袭性使得多数患者发现时已是中晚期［2－3］。因此，肺癌的治疗多采用手术为主，化疗联合中医药治疗的综合治疗方案［4］。

中医认为，肺癌为本虚标实之证，临床治疗肺癌在扶正的基础上，多与“清热解毒”“化痰散结”以及“活血化瘀”等祛邪法相结合［4］。斑蝥味辛，性热，具有破血逐瘀、散结消瘸、攻毒蚀疮的功效，斑蝥素是其主要成分，具有很强的抗癌作用，但同时具有较强的毒副反应。运用现代工艺提取得到的斑蝥酸钠既保留了斑蝥素的抗癌作用，也使其毒性大大降低［5］。以斑蝥酸钠为主要成分的斑蝥酸钠注射液作为肺癌的辅助化疗药物，较广泛应用于临床［6］，但对于肺癌的具体作用机制尚未明确。

磷脂酰肌醇3激酶／蛋白激酶B／哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphatidylinositol 3 kinases／protein kinase B／mammalian target of rapamycin，PI3K／AKT／mTOR）信号通路在肿瘤的发生发展中起重要作用，能够调节肿瘤细胞的生长、增殖，影响肿瘤细胞的血管生成及侵袭与转移能力［7］。本研究探究了斑蝥酸钠注射液干预下肺腺癌A549细胞增殖、侵袭与转移能力的变化，并初步探讨对PI3K／AKT／m TOR信号通路蛋白表达的影响，为斑蝥酸钠对肺癌相关疾病的作用机制研究提供参考。

1 材料

1.1 细胞株人肺腺癌A549细胞，由中国科学院上海细胞库提供，于37℃、5%CO2的条件下，采用1640完全培养基培养。

1.2 药物与试剂顺铂（cisplatin，DDP）注射液（江苏豪森制药有限公司，国药准字：H20040813）；斑蝥酸钠注射液（贵州金桥药业有限公司，国药准字：H52020601）。MTT粉末、胰蛋白酶（美国Sigma公司，批号：M2003、J170013）；1640培养基（美国Hyclone公司，批号：SH30809.01）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，美国Gibco公司，批号：10437028）；细胞裂解缓冲液、BCA蛋白浓度测定试剂盒（中国碧云天公司，批号：P0013、P0010）；PI3K、AKT、mTOR、P70 S6、GAPDH抗体（美国Cell Signaling Techology公司，批号：4249、4691、2983、2708、5174）；VEGF－C抗体（美国Abcam公司，批号：ab191274）；HRP标记的羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（华安生物公司，批号：G170628）；ECL化学发光试剂盒（美国Bio－Rad公司，批号：1705062）。

1.3 仪器Heracell 150i型恒温培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；1X71型倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；Universal HoodⅡ型SDS－PAGE凝胶成像分析仪、721BR08904型蛋白电泳槽（美国Bio－Rad公司）；Enspire型多功能酶标仪（美国Perkinelmer公司）。

2 方法

2.1 MTT实验取对数生长期的A549细胞，用胰蛋白酶消化后，将细胞悬液浓度调整为5×104mL－1。96孔板中每孔加入100μL细胞悬液，并分别 加 入 含0 mg·L－1、0.312 5 mg·L－1、0.625 mg·L－1、1.25 mg·L－1、2.5 mg·L－1、5 mg·L－1蝥酸钠注射液的10%FBS培养基100μL，设5个平行孔，处理24 h、48 h、72 h后，弃去上清，每孔加入20μL MTT溶液，4 h后吸除上清液，加入150μL DMSO，低速震荡10 min，酶标仪检测490 nm波长处的吸光度值，计算肿瘤细胞增殖抑制率。

肿瘤细胞增殖抑制率＝（1－药物组OD值／对照组OD值）×100%

2.2 细胞划痕实验取对数生长期A549细胞接种于6孔板，每孔约5×104个细胞，待细胞铺满后沿中线划出2 mm左右划痕，PBS清洗3次，加入无血清培养基，设空白对照组（control）、斑蝥酸钠注射液低剂量组（0.4 mg·L－1）、斑蝥酸钠注射液高剂量组（1 mg·L－1）、顺铂组（DDP，2 mg·L－1），置入培养箱，24 h后记录各孔划痕的距离。

2.3 Western blot实验A549细胞分组同2.2，孵育24小时后，用细胞裂解缓冲液在冰上提取30 min，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。取25 ng待测样品进行10%SDS－PAGE电泳分离，然后转移到PVDF膜。用5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗（1∶1 000）孵育过夜，二抗（1∶2 000）孵育2 h，应用凝胶成像系统扫描各蛋白条带灰度值，以待测蛋白和内参蛋白的灰度值比值作为待测蛋白的相对表达量。

2.4 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 斑蝥酸钠注射液对A549细胞增殖的影响MTT法检测不同浓度斑蝥酸钠注射液对A549细胞增殖能力的影响。药物干预24 h、48 h、72 h后，斑蝥酸钠注射液能够明显抑制A549细胞的增殖（P＜0.05，P＜0.01），且具有浓度与时间依赖性。见图1。后续实验选取24 h为药物干预时间，计算斑蝥酸钠注射液干预A549细胞24 h后，其半数抑制浓度（half maximal inhibition concentration，IC50）为1.58 mg·L－1。

图1 斑蝥酸钠注射液对A549细胞增殖的影响

3.2 斑蝥酸钠注射液对A549细胞迁移能力的影响细胞划痕实验检测斑蝥酸钠注射液对A549细胞迁移能力的影响。与对照组比较，经不同浓度斑蝥酸钠注射液处理后，各孔细胞迁移率显著降低（P＜0.05），提示斑蝥酸钠注射液能够抑制细胞迁移，并呈浓度依赖性。见图2。

图2 斑蝥酸钠注射液对A549细胞迁移能力的影响（×200）

3.3 斑蝥酸钠注射液对A549细胞PI3K／AKT／mTOR通路蛋白表达的影响为探讨斑蝥酸钠注射液抑制A549细胞侵袭与转移的作用机制，用Western blot检测PI3K／AKT／mTOR通路相关蛋白的表达水平。与对照组比较，斑蝥酸钠注射液处理后，PI3K、AKT、mTOR、P70 S6及VEGF－C的蛋白表达量显著降低（P＜0.05）。表明斑蝥酸钠注射液可能通过抑制PI3K／AKT／mTOR通路激活而抑制A549细胞的侵袭与转移。见图3。

图3 斑蝥酸钠注射液对A549细胞中PI3K／AKT／mTOR通路相关蛋白表达水平的影响

4 讨论

恶性增殖和转移是恶性肿瘤的重要特点，在肿瘤的发生发展中起到重要的作用，因此，抑制细胞增殖与转移是治疗恶性肿瘤的重要策略之一［8］。斑蝥是常用的抗肿瘤虫类中药，斑蝥酸钠是其主要成分斑蝥素的小分子衍生物［9］。斑蝥酸钠注射液在多种肿瘤治疗中均有良好效果［10－12］，在肺癌的治疗中亦有应用。研究表明，斑蝥酸钠注射液联合化疗治疗非小细胞肺癌，能够提高治疗的总有效率，且联合组患者治疗后血清中VEGF水平明显低于常规化疗组患者，而肿瘤坏死因子－α（tumor necrosis factorα，TNF－α）和白细胞介素－12（interleukin－12，IL－12）水平明显高于常规化疗组患者［13］。

本研究采用不同浓度斑蝥酸钠注射液干预A549细胞后，细胞增殖受到抑制，且与浓度和时间呈现明显依赖性。划痕实验显示，细胞向中心迁移的能力受抑制。这些结果均表明斑蝥酸钠注射液可抑制A549细胞的增殖和迁移，具有明显的抗肿瘤活性。

为进一步探讨斑蝥酸钠注射液抑制A549细胞增殖与转移的分子机制，本文研究了斑蝥酸钠注射液对A549细胞PI3K／AKT／mTOR信号通路的影响。PI3K／AKT／mTOR信号通路在肿瘤研究中起重要作用［14］，该通路的异常激活能够抑制肿瘤的凋亡与自噬［15－16］，促进肿瘤的增殖与转移［17］，影响肿瘤微环境［18］等。而大约90%的非小细胞肺癌细胞株，包括A549细胞，均存在PI3K／AKT／mTOR通路的激活［19］，其中，PI3K的亚单位p85a和p115a均呈现过表达的现象，而PI3K下游的信号因子AKT也因此呈现活化状态，活化的AKT能够促进糖原合成酶激 酶－3β（glycogen synthase kinase－3β，GSK－3β）、叉头框蛋白O（forkhead box protein O，FOXO）转录因子、核转录因子－κB（nuclear factorκB，NF－κB）等多个基因的表达，从而促进细胞增殖［20］。mTOR作为PI3K／AKT的下游信号因子，因PI3K／AKT的激活而呈活化状态。研究表明，mTOR能够参与调控上皮－间质转化（epithelial－mesenchymal transformation，EMT），调控血管内皮生长因子，影响肿瘤免疫微环境等多种细胞进程，从而影响肺癌细胞的增殖与迁移［21－23］。Western Blot实验表明，斑蝥酸钠注射液能够明显下调A549细胞中PI3K／AKT／mTOR通路相关蛋白的表达。因此，斑蝥酸钠注射液抑制A549细胞增殖与转移的作用机制可能与抑制PI3K／AKT／mTOR通路激活有关。

同时，PI3K／AKT可在基因水平上促进VEGF的合成［24］，VEGF－C作为VEGF家族中的一员，能够促进淋巴管内皮细胞的增殖及迁移，是诱导淋巴管生成的重要指标［25］，且在肺癌中高表达，与肺癌的增殖与转移密切相关［26］。已有研究表明，斑蝥酸钠能够有效抑制胃癌、肝癌等恶性肿瘤中VEGF－C的表达［27－28］，但对于肺癌中VEGF－C表达的影响鲜有报道。本研究表明，斑蝥酸钠注射液干预A549细胞后，VEGF－C的表达亦被抑制，表明斑蝥酸钠注射液抑制A549细胞增殖与转移可能的作用机制还可能与抑制血管生成有关，但具体机制仍需进一步探讨。

综上所述，斑蝥酸钠注射液能够抑制A549细胞的侵袭与转移，其机制可能与抑制PI3K／AKT／mTOR信号通路激活及血管生成有关。