基于IRE1α／JNK通路研究苁蓉舒痉颗粒对帕金森病模型大鼠的影响*

黄佩珍，唐岚芳，刘婷，钟佳男，林瑶，许茜，蔡晶

1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学，福建 福州 350122

帕金森病（parkinson′s disease，PD）是第二大神经退行性疾病，发病人群主要为65岁以上的老年人。中脑黑质－纹状体多巴胺神经细胞的变性坏死，多巴胺递质缺乏和路易小体（lewy bodies，LBs）为其主要病理改变［1－2］。研究表明，内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在PD发病机制中发挥了关键作用［3－4］。ERS无法逆转时会促进相关凋亡蛋白（基因）的表达，诱导细胞凋亡。研究发现，内质网跨膜蛋白肌醇需求激酶1α（inositol requiring cnzymelα，IRE1α）、c－Jun氨基末端激酶（c－Jun N－terminal kinase，JNK）所介导的ERS信号通路可调控细胞凋亡［5－7］。本课题组前期研究发现，苁蓉舒痉颗粒可以改善PD模型大鼠的运动障碍和认识功能［8－9］，但其作用机制还未明确。本研究通过观察苁蓉舒痉颗粒对PD模型大鼠脑黑质TH表达及脑额叶皮质IRE1α、p－IRE1α、JNK、P－JNK蛋白表达的影响，探讨其对PD模型大鼠的作用。

1 材料

1.1 动物SPF级雄性SD大鼠45只，8周龄，体质量200～240 g，购自杭州医学院，许可证号：SCXK（浙）2019－0002。饲养于福建中医药大学医学实验中心，使用许可证号：SKYX（闽）2017－0006。饲养条件为室温为20～22℃，相对湿度60%～65%，自动光暗控制。

1.2 药物与试剂苁蓉舒痉颗粒是本课题组已获国家授权的专利（专利号为：2011103028541）（福建中医药大学第三附属人民医院提供，由肉苁蓉、丹参、制黄精、赤芍、牡丹皮等药物组成）；葵花油、鱼藤酮（美国Sigma公司，货号分别为：A8007、H8923）；β－actin抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：66009）；IRE1α抗体、p－IRE1α抗体（北京博奥森生物技术有限公司，货号分别为：8680R、AP0878）；JNK抗体、p－JNK抗体（美国Abcam公司，货号分别为：ab179461、ab207477）；乌拉坦（武汉博士德生物工程有限公司，货号：s11036）；SDSPAGE凝胶配置试剂盒（上海碧云天生物技术研究所，货号：p0012a）；ECL化学发光检测试剂盒（美国Bio－Rad公司，货号：b500022）；PVDF膜（北京索莱宝科技有限公司，货号：w0162）；BCA蛋白定量试剂盒（福建迈新技术有限公司，货号：pt0001）。

1.3 仪器电子天平（上海奥豪斯仪器有限公司，型号：CP214）；制冰机（日本三洋电器集团，型号：SIM－F140）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司，型号：5417R）；倒置显微镜（日本Nikon公司，型号：TS100）；光学显微镜（德国Leica公司，型号：Mdl）；石蜡切片机（德国Leica公司，型号：RM2235）；石蜡包埋机（孝感亚光医用公司，型号：YB－7LF）；电泳仪（美国Bio－Rad公司，型号：PowerPac Basic）；转膜仪（美国Bio－Rad公司，型号：PowerPac Basic）；化学发光成像仪（美国Bio－Rad公司，型号：Universal Hood）；恒温磁力搅拌器（杭州仪表电机厂，型号：78HW－I）；实验室超纯水器（美国Millipore公司，型号：MILLI－Q）；展片机（德国FGL公司，型号：1052）。

2 方法

2.1 动物分组及造模将45只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组和苁蓉舒痉颗粒（5.21 g·kg－1）组，除正常组外，其余各组大鼠采用颈背部皮下注射鱼藤酮葵花油乳化液（1.5 mg·kg－1）（按1.5∶1将鱼藤酮、葵花油配为鱼藤酮葵花油乳液）制备PD模型［10－11］，连续给予14 d。造模过程中出现静止性震颤、肌强直、运动迟缓、步态姿态异常等症状则视为造模成功。正常组正常喂养，不予处理。

2.2 干预方法苁蓉舒痉颗粒人的用量为50 g（生药）·60 kg－1，按照成人与大鼠给药量换算得大鼠给药剂量为5.21 g·kg－1，每天1次，连续给药14 d，正常组和模型组则给予同体积的蒸馏水灌胃。

2.3 免疫组化法检测大鼠脑黑质酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）表达每组随机取4只大鼠，用体积分数20%乌拉坦腹腔麻醉，心脏灌注后，取完整的脑组织固定于40 ng·L－1多聚甲醛，脱水浸蜡，包埋后的组织块放于切片机标本固定架上，切片厚度为4μm，再放入58℃烘箱中烘片6～8 h；脱蜡30 min，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ复水5 min后，依次在100%乙醇Ⅰ、Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、Ⅱ、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中脱水5 min，PBS冲洗3次，每次5 min；高温修复后待自然冷却，PBS冲洗3次，每次5 min；用3%H2O2再孵10 min，PBS冲洗3次，每次5 min；封闭2 h，滴加TH（1∶200）一抗孵育，将切片放入37℃烘箱复温30 min，再用DAB显色液显色，放入纯水中停止显色；将切片吹干，用树胶封片，在显微镜下观察。

2.4 Western Blot法检测大鼠额叶相关蛋白表达

每组随机选择6只大鼠，用体积分数20%乌拉坦腹腔麻醉后，断头留脑，将其放置于冰盘上，切下额叶部分，提取蛋白后，用BCA试剂盒检测蛋白浓度，按4∶1加上样缓冲液，将样品放入沸水中变性。配胶，上样至10%SDS－PAG电泳，电压20 V／10 min、80 V／30 min、120 V／60 min，使蛋白跑到胶底部，按蛋白分子量大小切下所需要条带，转膜至PVDF膜，2 h后放入配好的IRE1α、p－IRE1α、JNK、p－JNK、β－actin抗体（抗体∶抗体稀释液＝1∶1 000），4℃孵育，用TBST洗膜，然后将条带放于二抗（抗体∶抗体稀释液＝1∶2 000）中，摇床中孵1 h后，将ECL发光液加到PVDF膜上进行曝光成像。用ImageLab软件分析蛋白条带的灰度值。

2.5 统计学方法采用SPSS 24.0软件进行数据分析，计量资料使用均数±标准差（±s）表示。组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较，方差齐则采用LSD法，方差不齐则采用Games－Howell法。P＜0.05则表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 苁蓉舒痉颗粒对PD模型大鼠脑黑质HT阳性表达的影响与正常组比较，模型组大鼠脑黑质TH阳性细胞数明显减少（P＜0.05）；与模型组比较，苁蓉舒痉颗粒组大鼠脑黑质TH阳性细胞数明显增加（P＜0.05）。见图1。

图1 苁蓉舒痉颗粒对PD模型大鼠脑黑质HT阳性表达的影响

3.2 苁蓉舒痉颗粒对PD模型大鼠脑额叶相关蛋白表达与正常组比较，模型组大鼠脑额叶p－IRE1α／IRE1α、p－JNK／JNK水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，苁蓉舒痉颗粒组大鼠脑额叶p－IRE1α／IRE1α、p－JNK／JNK水平明显降低（P＜0.05）。见图2。

图2 苁蓉舒痉颗粒对PD模型大鼠脑额叶相关蛋白表达

4 讨论

PD是次于痴呆的第二大常见的神经系统疾病，现阶段PD的病因并未明确，患者早期有运动迟缓、弓背、静止性震颤等症状［12－13］。随着病情发展加重，伴发抑郁［14－15］、焦虑［16－17］等精神性症状和丧失部分生活自理能力，这给家庭及社会带来巨大的压力［18］。

帕金森病属于中医学“震颤”“痉证”等范畴，基本的病机为本虚标实，肝肾亏虚、气血不足为本，风、火、痰、瘀为标。肾藏精生髓，脑为髓之海，肾虚则精不上承而脑髓空虚；肾精亏虚，水不涵木，则虚风内动，发为震颤；肾精亏虚，筋脉失于濡养，加重震颤，因此需要补肾益髓。苁蓉舒痉颗粒的君药为肉苁蓉，具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效，有保护神经系统、抗衰老、提高免疫力等药理作用［19－20］。研究发现，肉苁蓉的有效成分松果菊苷对PD模型大鼠海马及细胞外液的单胺类神经递质的减少有保护作用［21］。也有研究发现，肉苁蓉有效成分肉苁蓉多糖可以改善PD模型大鼠的症状，上调脑黑质Wnt1、β－catenin蛋白表达，降低GSK－3βmRNA水平，对DA能神经细胞有保护作用［22］。本课题组前期临床试验表明，苁蓉舒痉颗粒可以改善患者行为能力、降低帕金森氏病综合评分［23］，还可以改善PD模型大鼠行为障碍、促进神经营养因子的表达、减轻内质网应激水平和线粒体氧化应激水平［24－25］。

长时间的ERS，内皮网上的蛋白质负载超过其折叠能力时，可诱导细胞凋亡。跨膜蛋白IRE1α［26］分布于内质网上，由N端腔传感器结构域，单个跨膜结构域和C端胞质效应子组成，调控蛋白激酶、核糖核酸内切酶的活性。跨膜蛋白IRE1α也可诱导多巴胺神经细胞凋亡，其结合TRAF2（肿瘤坏死因子受体相关因子2）、ASK1（凋亡信号调节激酶），形成TRAF2－ASK1－JNK复合体，从而激活JNK通路。活化的JNK（丝裂原活化蛋白激酶）可调节凋亡相关基因Bcl－2或直接激活Bcl家族中的Bax，促使细胞凋亡［27－29］。

本研究结果显示，经鱼藤酮造模后，PD模型大鼠有静止性震颤、运动迟缓、弓背、姿态步态异常等行为学障碍，其黑质多巴胺神经元明显缺失；经苁蓉舒痉颗粒剂治疗后，多巴胺神经元缺失数量较模型组有所减少，表明苁蓉舒痉颗粒对脑黑质多巴胺神经元有一定的保护作用。同时也可降低大鼠脑额叶p－IRE1α／IRE1α、p－JNK／JNK水平，表明苁蓉舒痉颗粒可能通过调节IRE1α／JNK通路来缓解ERS，从而保护PD模型大鼠的神经元功能。但本研究中未对IRE1α／JNK信号通路中所有相关蛋白进行检测及缺少PD模型大鼠行为学的检测，故有待进一步研究。