微调3号方调控巨噬细胞表型转化对HT－29细胞侵袭能力的影响*

赵璐，倪依群，尤建良

南京中医药大学附属无锡市中医院，江苏 无锡 214071

研究发现，长期处于慢性应激状态的肿瘤患者，机体会释放大量肾上腺素（epinephrine，E）、去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）、皮质醇等激素至外周血中。其中，NE对机体免疫功能的影响已受到学者们的广泛关注，作为一种经典的神经递质，NE可通过β－肾上腺素能（β－adrenergic receptor，β－AR）信号通路改变肿瘤的生物学行为和肿瘤所处的微环境，提高肿瘤细胞的迁移和侵袭能力［1］。而长期反复应激会促使NE的释放从而致使机体炎症和免疫功能发生改变，甚而影响到个体健康状态。无论是交感神经释放的NE，还是自身受到脂多糖刺激后分泌的NE，都使巨噬细胞处于一个富于NE的微环境中。而在肿瘤微环境中存在两类生物学特征完全不同的巨噬细胞，一类为发生经典极化（classical polarization）的M1型，另一类为替代极化（alternative polarization）的M2型，M2型巨噬细胞可抑制细胞免疫应答，促进血管生成因子、金属基质蛋白酶、生长因子等的释放，从而影响肿瘤的增殖与转移［2］。

中药复方制剂微调3号方（WD－3）为微调平衡理论的基本方［3］，我科前期大量的临床及实验研究证实，WD－3具有延长晚期肿瘤患者生存期，改善生存质量及抗肿瘤转移的作用［4－6］，但其作用机制尚不明确。本实验将观察NE和WD－3药物血清对巨噬细胞表型转化及其对结肠癌细胞侵袭能力的影响，从而探讨WD－3抗肿瘤转移可能的作用机制。

1 材料

1.1 实验细胞与动物人单核细胞白血病细胞（human monocyte leukemia cells，THP－1，细胞目录号：TCHu 57）、人结肠癌细胞株（human colon cancer cell，HT－29，细胞目录号：TCHu103），购自中国科学院细胞库。

SPF级健康雄性SD大鼠20只，6月龄，体质量250～280 g，购自上海斯莱克实验动物中心，许可证号：SCXK（沪）2012－0002，常规饲料喂养，自由饮食饮水。实验方案经过南京中医药大学附属无锡市中医院伦理委员会审查。

1.2 药物与试剂微调3号方（WD－3）由党参、茯苓、猪苓、薏苡仁、白术、陈皮、枇杷叶等组成，为无锡市中医医院院内液体制剂｛苏食药监注［2005］401号，苏药制字204002111｝。RPMI－1640细胞培养基、DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（美国Thermo Fisher Scientific公司，批 号：C22400500BT、11965092、R001100、10099141）；佛波酯（phorbol ester，PMA）、NE、青霉素－链霉素双抗（美国Sigma－Aldrich公司，批号：P21120、A7257、V900929）；Anit－CD206抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs－4727RAPC）；Anti－CD64抗体、环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）ELISA Kit（英国Abcam公司，批号：ab93500、ab133051）；人白介素10（Human interleukin 10，Human IL－10）ELISA试剂盒、Human IL－12 ELISA试剂盒（美国R＆D公司，批号：S1000B、S1200）；IL－4、戊巴比妥钠、水合氯醛（德国Merck公司，批号：SRP3093、P11011、47335－U）；磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer，PBS，北京索莱宝科技有限公司，批号：P1020）；基质胶（美国BD公司，批号：356234）；甲醇、结晶紫（国药集团化学试剂有限公司，批号：YC－SJ06009、548－62－9）。

1.3 仪器7000型细胞培养箱（美国Napco公司）；SC2－4A1型二级生物安全柜（新加坡ESCO公司）；5427R型低温高速离心机（德国Eppendorf公司，离心半径：8 cm）；CKX41型荧光倒置显微镜（日本Olympus公司）；800TS型酶标仪（美国BioTek公司）；LSRⅡ型流式细胞仪（美国BD公司）；353097型Transwell培养板、657638型Transwell小室（美国BD Falcon公司）。

2 方法

2.1 WD－3含药血清制备20只SD大鼠按随机数字表分为对照组和药物组，每组10只。药物组大鼠每天灌胃给予WD－3溶液2 mL，每日2次，对照组大鼠给予等体积生理盐水，连续给药5天，且第5日晨间给予当日一天剂量。末次给药前禁食12 h，给药2 h后，按2 mL·kg－1的剂量腹腔注射3%戊巴比妥钠，大鼠麻醉后腹主动脉采血。采血后，根据《关于善待动物的指导性意见》，对大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉过量致死。血清静置2 h后，5 000 rpm·min－1离心10 min分离血清，56℃水浴灭活30 min，0.22μm滤器过滤除菌并分装，－20℃冰箱保存备用。

2.2 实验分组及M2型巨噬细胞诱导分化将THP－1细胞置于含10%FBS、2 g·L－1碳酸氢钠、100 U·mL－1青霉素－链霉素双抗的RPMI－1640培养基中，放入37℃、5%CO2的培养箱中培养。取生长状态良好、呈对数生长期的细胞，调整细胞密度为2×105mL－1，接种于6孔板中，每孔加入含200 nmol·L－1PMA的培养液4 mL，培养48 h，使其诱导分化成巨噬细胞。待巨噬细胞呈贴壁状态，将巨噬细胞分为A、B、C、D四组，A、B组分别采用10%空白血清培养基和10%WD－3药物血清培养基处理48 h，C、D组预先采用含10μmol·L－1NE的完全培养基培养24 h后，再分别使用10%空白血清培养基和10%WD－3药物血清培养基培养24 h。之后A、B、C、D每组分别加入含10μg·L－1IL－4的培养液4 mL处理24 h，将巨噬细胞进一步诱导为M2型巨噬细胞［7］。

2.3 流式细胞术检测巨噬细胞表面CD64、CD206的表达上述分组培养诱导的M2型巨噬细胞，经胰蛋白酶消化后PBS洗涤3次，调整细胞浓度至1×105mL－1，加入CD64－PE或CD206－PE抗体3μL，4℃避光染色30 min，流式细胞仪检测细胞表型及比例。

2.4 ELISA检测细胞上清液中IL－10、IL－12及cAMP的含量严格按照ELISA试剂盒说明书操作，检测各组细胞上清液中IL－10、IL－12、cAMP的水平。

2.5 共培养体系的建立及Transwell侵袭实验

取1 g·L－1基质胶20μL铺于Transwell小室底部，37℃培养箱静置1 h，待基质胶凝固。在12孔板中放入Transwell细胞共培养小室，0.41μm PVDF膜分隔上下室。下室分别加入5×104个M2型巨噬细胞（上述2.2项下方法所得），上室加入2×104个HT－29细胞，建立非接触式共培养体系。培养48 h后取出上室，将上室没有穿膜的细胞擦去，将Transwell小室置于甲醇溶液中固定10 min，0.1%结晶紫染色，置于倒置显微镜下统计未穿膜的细胞，每组随机选择5个视野进行统计分析。

2.6 统计学分析采用SPSS 21.0统计分析软件对数据进行统计分析，计量资料以平均值±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验。多组间比较，符合正态分布和方差齐性时，采用单因素方差分析；方差不齐进行对数转换，方差齐后进行单因素方差分析；若转换后方差仍不齐，则采用Kruskal－Wallis非参数检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 WD－3含药血清对巨噬细胞表型转化的影响

流式细胞仪检测细胞CD64及CD206的表达发现，与A组比较，C组表达CD64及CD206的细胞百分比显著升高（P＜0.05），提示NE可促进巨噬细胞向M2表型转化；与C组比较，WD－3药物血清干预后的D组表达CD64及CD206的细胞百分比显著下降（P＜0.05）。提示WD－3药物血清可减弱NE促进巨噬细胞向M2型表型转化的能力。见图1、图2。

图1 不同药物处理组CD64的表达情况

图2 不同药物处理组CD206的表达情况

3.2 WD－3含药血清对M2型巨噬细胞分泌IL－10、IL－12的影响与A组比较，C组细胞上清液中IL－10水平显著增加（P＜0.05），而B组细胞上清液中IL－12含量显著升高（P＜0.05），提示NE能促进巨噬细胞向M2型巨噬细胞发生转化，而WD－3可促进巨噬细胞向M1型发生转化。与C组比较，WD－3药物血清对M2型巨噬细胞进行处理后，D组细胞上清液中IL－10的水平明显下降（P＜0.05），提示WD－3药物血清可减弱NE促进巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化的能力。见图3。

图3 各组细胞分泌IL－10、IL－12的情况

3.3 WD－3含药血清对M2型巨噬细胞调控HT－29细胞侵袭能力的影响通过共培养体系的Transwell侵袭实验发现，与A组比较，C组HT－29细胞的侵袭能力显著升高（P＜0.05）；与C组比较，D组HT－29细胞的侵袭能力则显著减弱（P＜0.05）。提示M2型巨噬细胞能提高HT－29细胞的侵袭能力，而WD－3药物血清能够拮抗M2型巨噬细胞的这一作用。见图4。

图4 各组HT－29细胞侵袭能力

3.4 WD－3含药血清对M2型巨噬细胞cAMP的影响与A组比较，C组细胞中cAMP含量显著升高（P＜0.05）；与C组比较，D组细胞上清液中cAMP含量显著减少（P＜0.05）。见表1。

表1 各组细胞cAMP表达情况 （±s）

表1 各组细胞cAMP表达情况 （±s）

注：与A组比较，*P＜0.05；与C组比较，△P＜0.05

组别 cAMP（ρ／ng·L－1） 组别 cAMP（ρ／ng·L－1）A *198.42±1.52 C 461.97±2.07 B △182.73±1.96 D 208.75±1.57

4 讨论

在肿瘤的复发转移过程中，巨噬细胞发挥着重要的作用。巨噬细胞广泛分布于人体各个器官，是机体重要的一类表型可变、功能多样的免疫细胞，易受不同微环境的影响被极化成功能不同的亚型。在肿瘤微环境中，巨噬细胞占肿瘤间质免疫细胞总数的50%以上，被称为肿瘤相关巨噬细胞（Tumor－associated macrophage，TAM）。TAM是实体肿瘤间质的主要组成部分，在肿瘤间质中聚集，与肿瘤细胞分泌的大量趋化因子，如：巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M－CSF）、单核细胞趋化蛋白－1（monocyte chemoattractant protein－1，MCP－1）、趋化因子CC基序配体3［chemokine（C－Cmotif）ligand 3，CCL3］、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管生成素－2（angiopoietin－2，Ang－2）等相关［8－10］。TAM至少包括2种不同活化表型和功能特征的亚群，即M1型和M2型。其中M1型TAM主要由干扰素γ（interferon gamma，IFN－γ）和脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）诱导，呈递Ⅰ型免疫应答，是机体免疫系统的重要组成成员，通过分泌促炎性细胞因子，发挥杀菌和抗肿瘤作用。而M2型TAM则受肿瘤细胞或T细胞来源的IL－4、IL－13或糖皮质激素以及其他免疫复合物诱导而成，表达CD64、CD206等特征性蛋白分子，产生Th2型细胞因子，促进白细胞介素－10（interleukin－10、IL－10）的分泌，进而降低机体免疫系统的抗肿瘤活性。同时，M2型TAM能促进肿瘤新生血管的形成，从而有助于肿瘤的生长、浸润及转移［11－12］。由此可见，肿瘤微环境中不同类型的巨噬细胞从多方面广泛参与肿瘤进程，而M2型巨噬细胞主要具有抑制杀伤性T淋巴细胞的作用，促进肿瘤免疫逃逸以及对当前治疗的抵抗。在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等多种肿瘤的发生发展中，TAM均扮演重要的角色，因此，进一步阐明肿瘤细胞与巨噬细胞的相互关系，找到其促癌及抑癌作用的平衡点，对提高肿瘤的临床疗效具有重要的意义［13－16］。

研究表明，慢性应激可提高肿瘤组织和外周血交感神经递质NE、E的水平，促进模型动物肿瘤的生长和转移［17－19］。肿瘤组织包括结肠癌组织有交感神经分布，有β肾上腺素能受体表达，交感神经末梢释放的儿茶酚胺局部可达到微摩尔水平，渗入及肾上腺髓质分泌入血的儿茶酚胺可达到纳摩尔浓度［20－22］。

应激相关激素NE对机体免疫功能的影响已受到学者们的广泛关注，长期反复应激导致NE释放从而致使机体炎症和免疫功能发生改变，甚而影响到个体健康状态，提示交感神经系统与免疫系统间相互作用的紧密性和直接性。无论是交感神经释放NE，还是自身受到LPS刺激后分泌NE，巨噬细胞均处于一个富于NE的微环境［22］。

肿瘤发生发展的整个过程也是肿瘤细胞与机体细胞相互作用的过程，当人体中原位癌基因被激活或抑癌基因被抑制时，可导致肿瘤的发生发展。在此过程中病人始终处于变动的不平衡状态，表现为脏腑功能失调，气血阴阳紊乱，津液运化失常，日久而成肿瘤。三焦为气血津液运行通路，因中焦主化生气血津液，所以位居三焦枢纽。中焦脾胃失调，则气血运行不畅而生痰湿瘀血，气血生化无源而正气不足。因此，中焦脾胃在肿瘤的形成发展中具有重要的作用。基于以上认识，赵景芳教授提出“微调平衡理论”，认为肿瘤的治疗应立足中焦脾胃，顾护后天之本。不断追踪某一时期机体所处的不平衡状态，找到内在“失衡的关键点”，通过不断调节人体内环境、调节肿瘤与机体免疫，使其逐渐达到一个相对的平衡状态。WD－3由党参、茯苓、猪苓、薏苡仁、白术、陈皮、枇杷叶等组成，其中党参、猪苓为君，健脾益气；白术、茯苓健脾除湿，以助运化；薏苡仁助白术、茯苓健脾渗湿，益以半夏化痰湿、补脾气；陈皮芳香健脾醒胃；佐以枇杷叶降逆和胃。全方重在微调中焦脾胃之气，调气以化瘀，改善机体高凝状态而无肿瘤脱落扩散之虞；健脾以化湿，使痰湿生成无源而达正本源清之目的；健脾以扶正，发挥正气固摄作用而抑制肿瘤扩散转移。通过平衡阴阳气血而调动机体自身的免疫功能，达到抗肿瘤转移的目的。我科前期研究发现，WD－3可显著提高晚期肿瘤患者的生活质量、延长生存期，目前已作为院内制剂广泛应用于临床。研究发现，WD－3具有抑制小鼠S－180肉瘤生长的作用，抑瘤率达29%，与对照组比较有显著性差异，并且能显著提高细胞因子IL－2、IL－4、IFN－γ的水平，提示WD－3抗肿瘤转移的可能机制在于调整机体的免疫状态［23－25］。

M2型巨噬细胞可表达CD64、CD206等特征性蛋白分子，本实验结果提示，将THP－1细胞进行NE预处理后，再进一步诱导分化，能显著提高细胞CD64及CD206的表达，提示NE能促进巨噬细胞向M2型极化［26－27］。而经过WD－3药物血清同时干预后，细胞CD64及CD206的表达均减少，提示WD－3能够减弱NE调控巨噬细胞向M2型发生转化的作用。本实验同时发现，NE能够促进细胞分泌IL－10，但并未对IL－12产生影响，同样说明NE能促进巨噬细胞向M2型发生转化，而WD－3能够减弱NE的作用。进一步建立结肠癌—巨噬细胞共培养体系，观察M2型巨噬细胞对结肠癌细胞侵袭能力的影响，结果显示，在富集更多M2型巨噬细胞的条件下，HT－29侵袭能力得到进一步提高，而WD－3药物血清可以显著减弱NE促进巨噬细胞向M2型发生转化的作用，从而减弱HT－29细胞的侵袭能力。相关研究证明，NE通过激活β－AR，引起Ga蛋白介导的腺苷酸环化酶的活化，在该酶的作用下，ATP转化为cAMP，cAMP进一步通过下游效应系统调节细胞活动。本实验同样证实，NE可显著提高细胞cAMP含量，并且进一步发现，WD－3能够降低cAMP的生成。因此，WD－3是否通过β－AR信号通路发挥效应值得进一步研究。

综上所述，WD－3可抑制巨噬细胞向M2表型转化，从而减弱结肠癌细胞HT－29的侵袭能力。本结果将为进一步研究WD－3抗肿瘤转移机制提供基础，为肿瘤免疫治疗提供理论依据。