Streptomyces alboflavus TD-1产挥发性抑菌物质对黄曲霉菌生长及其毒素的抑制作用

张晓君，路来风，李淑华，王昵霏，李王强，王安琪，宋冠林，李贞景，王昌禄*

（省部共建食品营养与安全国家重点实验室，天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457）

链霉菌产生的代谢产物具有免疫抑制、抗癌、抗真菌及细菌等多种功能[1-2]，在植物病害、储粮及饲料防霉、抑制毒素等方面具有广泛应用[3]。调控链霉菌一个重要的机制为碳分解代谢抑制。葡萄糖是一种可被快速利用的碳源，可以起到缩短菌体延滞期和促进菌体生长的作用[4]，碳源较多的培养基可延缓菌丝自溶，有利于合成代谢产物积累，反之，碳源稀薄则会导致菌丝早期自溶[5]。当碳源浓度过高，又会使许多化合物的成受阻[6]。Romero-Rodríguez等[7]发现，高浓度葡萄糖会抑制链霉菌在固体培养基上的孢子形成。只有在葡萄糖被消耗到一定程度，阻遏作用被解除时才开始合成次级代谢产物[8-9]。

微生物代谢产生的挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs）在控制病原菌方面有巨大潜力[10]，其分子质量低、可快速降解[11]，对植物病原菌显示出良好的拮抗活性[12-13]。此外，利用食品级VOCs保护农作物和动物免受真菌病原体的侵害也受到广泛关注[14]。已有研究发现，1-辛烯-3-醇和其他VOCs（如反式-2-己醛）是拮抗青霉菌和其他真菌的有效熏蒸剂[15-17]。作为一种食品级VOCs，1-辛烯-3-醇最初在真菌中发现，后来也在多种植物中发现[18-19]，是植物细胞反应、植物-食草动物相互作用和植物-植物相互作用的信号分子[20]，也是抑制丝状真菌萌发的信号化合物[15]，但是，目前1-辛烯-3-醇作为一种挥发性信号化合物对其他真菌及其生理机制影响的研究并不深入。

黄曲霉（Aspergillus flavus）是一种常见霉菌，多存在于发霉的粮食及饲料中，部分黄曲霉菌还能产生黄曲霉毒素，其中黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）毒性最强。黄曲霉毒素对人类和家畜都有很强的毒性及致癌性。生物防治具有无污染、对人体健康无不良影响等优点，应用前景广阔。因此，利用生物防治法预防粮食及饲料等发生霉变具有重要意义[21]。

本实验以课题组早期从土壤中分离的白黄链霉菌TD-1（Streptomyces alboflavusTD-1）为拮抗菌，研究其在不同浓度葡萄糖培养基中的生长情况及其产生的VOCs对黄曲霉菌生长的影响，并对VOCs组分进行鉴定分析，筛选出一种食品级单体化合物1-辛烯-3-醇，对其拮抗黄曲霉的抑菌机理及抑制黄曲霉毒素合成的调控机制进行研究，旨在为微生物源VOCs在食品中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

拮抗菌：白黄链霉菌TD-1，本实验室专利菌种。指示菌：黄曲霉，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC 2219）。

1.1.2 培养基

链霉菌采用高氏一号改良MM培养基进行培养，其中，种子培养基为不加葡萄糖的MM培养基，接种量为10%，28 ℃培养48 h备用。

高氏一号改良MM培养基：黄豆粉5.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4•7H2O 0.2 g，FeSO4•7H2O 0.01 g，蒸馏水1 000 mL（固体培养基加2%琼脂粉）。

将100 mL高氏一号改良培养基分装到250 mL三角瓶中，使用时每瓶加入10 mol/L葡萄糖5.0、0.5、0.05 mL和0 mL，分别制成500、50、5 mmol/L和0 mmol/L浓度葡萄糖MM培养基，pH 7.0。

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：将市售马铃薯洗净、去皮，称量200 g后切块，加水煮沸20～30 min，8 层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖20 g，搅拌均匀，稍冷却后加水至1 L，pH值自然，加入琼脂30 g。

以上培养基灭菌条件为121 ℃、20 min。

1.1.3 试剂

罗丹明123、二甲基亚砜（均为分析纯） 北京索莱宝生物科技公司；乙醇、甲醇、乙腈、二氯甲烷（均为分析纯） 天津康科德科技有限公司；1-辛烯-3-醇（分析纯） 天津索罗门生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

LS-B50L型立式压力蒸汽灭菌锅 上海华线医用核子仪器有限公司；HYG-IIa型迴转式恒温调速摇床上海欣蕊自动化设备有限公司；XMTD-1000型电热鼓风干燥箱 天津市天宇实验仪器有限公司；LRH-250-GII型恒温培养箱 珠江广东省医疗器械厂；Allegra X-30型台式高速离心机 美国Beckman公司；1200型高效液相色谱仪 美国Agilent公司；QP2010 Ultral型气相色谱-质谱联用仪 日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖浓度对白黄链霉菌TD-1生长的影响

将含有不同浓度葡萄糖的MM培养基倒平板并晾干，等距离放置3 个直径6 mm的滤纸片，吸取3 μL 1×107个/mL白黄链霉菌TD-1孢子悬浮液，滴于滤纸片上，立即用封口膜进行密封，28 ℃培养，在第3、5、7、10、12、14天采用十字交叉法测定菌落直径。

1.3.2 葡萄糖浓度对白黄链霉菌TD-1生物量的影响

在含有不同浓度葡萄糖的MM培养基上平铺一层已灭菌玻璃纸，吸取100 μL白黄链霉菌TD-1孢子悬浮液（106～108CFU/mL），均匀涂布于玻璃纸上，立即用封口膜进行密封，28 ℃培养10 d。将玻璃纸上的菌丝刮下，称其湿质量，50 ℃烘箱中烘干，称其干质量。

1.3.3 葡萄糖浓度对白黄链霉菌VOCs抑制黄曲霉菌生长的影响

采用双皿对扣法[22]，吸取100 μL白黄链霉菌TD-1孢子悬浮液，均匀涂布于不同浓度葡萄糖平板上，制成下板；在上平板正中央放入一个直径为6 mm的滤纸片，吸取3 μL黄曲霉孢子悬浮液，滴于滤纸片上，空白组（CK）下板为纯培养基，不涂布链霉菌孢子悬浮液。将上下两板对扣，28 ℃培养，观察黄曲霉生长状况。

1.3.4 不同浓度葡萄糖培养白黄链霉菌TD-1产生VOCs的气相色谱-质谱分析鉴定

采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术，对含有不同浓度葡萄糖的白黄链霉菌TD-1液态发酵过程中产生的VOCs进行收集和鉴定。在第0、2、4、6、8天进行取样。参照Yang Mingguan等[23]方法，取5 mL白黄链霉菌TD-1发酵液，放入顶空进样瓶中进行VOCs吸附及气相色谱-质谱分析。

1.3.5 1 -辛烯-3-醇对黄曲霉产孢能力和生长情况的影响

采用双皿对扣法[22]测定挥发性单体物质对黄曲霉的抑制作用，略作修改：在培养基中央放置一个直径为6 mm滤纸片，吸取3 μL黄曲霉孢子悬浮液，滴于滤纸片上；取1-辛烯-3-醇放置在另一个皿底中，迅速将两皿对扣，用双层封口膜进行密封，28 ℃培养5 d，采用十字交叉法测量各菌落直径，用体积分数0.05% Tween 80溶液洗下黄曲霉孢子，用血球计数板计数各组黄曲霉孢子数量。以添加同体积无菌水进行对扣，作为空白对照实验，进行3 次平行，重复操作3 次。

按照式（1）计算对黄曲霉生长抑制率，按式（2）计算对黄曲霉产孢抑制率：

1.3.6 1 -辛烯-3-醇对黄曲霉孢子和菌丝体微观形态的影响

按照Li Qian等[24]方法，用扫描电子显微镜观察1-辛烯-3-醇处理后黄曲霉孢子和菌丝体微观形态的变化。

1.3.7 1 -辛烯-3-醇对黄曲霉线粒体膜电位的影响

采用罗丹明123染色法检测1-辛烯-3-醇处理后黄曲霉线粒体膜电位的变化[25-26]。吸取100 μL黄曲霉孢子悬液（1×105CFU/mL），均匀涂布在PDA培养基中，将已经灭菌的盖玻片以45°角插入培养基中，28 ℃预培养36 h，暴露在10 μL/L的1-辛烯-3-醇环境中12 h和24 h，用镊子将插入的盖玻片夹出，将10 μmol/L罗丹明123溶液与菌丝体混合，在黑暗条件下37 ℃孵育30 min，用磷酸盐缓冲液洗涤3 次载玻片，吸干水分，在倒置荧光显微镜下进行观察。

1.3.8 1 -辛烯-3-醇对AFB1生物合成的影响

黄曲霉的培养同1.3.6节黄曲霉菌丝体的培养方法。

AFB1的提取：用打孔器（6 mm）打取5 个长满黄曲霉菌丝体的琼脂块，用15 mL二氯甲烷浸提，室温下振动30 min，将提取液吸出，重复2 次，合并提取液，3 000 r/min离心10 min，用真空浓缩仪浓缩干燥，加入1 mL流动相（乙腈-甲醇-水（1∶1∶2，V/V））溶解凝结物，用0.22 µm滤膜过滤，待测。

参照宋文静[27]的方法测定AFB1。

1.4 数据处理与分析

结果采用SPSS 18.0软件进行显著性差异分析，P＜0.05，差异显著。所有数值均以±s表示，采用Origin 9.0进行作图。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖浓度对白黄链霉菌生长的影响

控制碳源含量是许多微生物优化发酵和控制培养条件的关键[28]。白黄链霉菌TD-1在葡萄糖浓度分别为0、5、50、500 mmol/L及N-乙酰-D-葡萄糖胺培养基中生长情况如图1所示。在葡萄糖浓度增加的情况下，TD-1的生物量都呈现增长趋势。在浓度为500 mmol/L时，其湿质量为247.1 mg，干质量为55.6 mg。TD-1在高氏一号改良MM培养基（未添加葡萄糖）生长的菌落直径最大，随着时间的延长其菌落逐渐变大，在10～14 d时直径变化不明显，且菌落开始变黑。随着葡萄糖浓度逐渐增大，菌落直径呈现下降趋势，较无葡萄糖小，第7天以后链霉菌菌斑变厚，浓度为500 mmol/L时，TD-1菌落在发酵后期最厚且无发黑现象，添加N-乙酰-D-葡萄糖胺的效果没有添加葡萄糖效果好。说明添加速效碳源有利于链霉菌生长，且可以减少其自溶现象。

图1 葡萄糖浓度对白黄链霉菌TD-1生长的影响Fig.1 Effects of different concentrations of glucose on the growth of S.alboflavus TD-1

2.2 葡萄糖浓度对白黄链霉菌产VOCs抑制黄曲霉菌能力的影响

如图2A所示，与CK相比，白黄链霉菌TD-1对黄曲霉的抑制作用极为明显，其菌丝体及孢子较少，对扣过程中其孢子和菌丝体没有掉落在对扣板上，CK掉落在对扣板上的菌丝体和孢子较多。葡萄糖浓度为0、5 mmol/L时，黄曲霉孢子产生的相对较多，菌丝体较少，50、500 mmol/L的孢子较少，菌丝体较多，说明葡萄糖浓度越高白黄链霉菌TD-1产生的VOCs对黄曲霉孢子萌发的抑制作用越强，50、500 mmol/L产生的VOCs抑菌能力较0、5 mmol/L强。

由图2B可知，TD-1在高氏一号改良MM培养基（即葡萄糖浓度为0 mmol/L）培养时，开始产生的挥发性成分较其他浓度高，但总峰面积增幅较小，在第8天时明显减少，葡萄糖浓度为5 mmol/L时产生的挥发性成分相对其他浓度较少，但一直呈现增长趋势；葡萄糖浓度为50 mmol/L时，在0～4 d的挥发性成分产量大幅增加，在第4天达到最高值，但后期明显下降；葡萄糖浓度为500 mmol/L时，0～2 d产挥发性成分少，但在2～4 d挥发性成分增长幅度明显升高，4 d以后产挥发性成分较为稳定，且超过50 mmol/L时VOCs产量为4 种葡萄糖浓度中最高。说明葡萄糖浓度过高在发酵初期有分解代谢阻遏，到后期高浓度的葡萄糖为菌体的生长提供了丰富的碳源和能量来源，延缓了菌体的自溶，为代谢产物的生物合成提供了保障。

图2 葡萄糖浓度对白黄链霉菌TD-1产生的VOCs抑制黄曲霉能力（A）及产VOCs总峰面积（B）的影响Fig.2 Influence of different glucose concentrations on anti-A.flavus effect (A) and total peak area of VOCs produced by S.alboflavus TD-1 (B)

2.3 不同浓度萄糖培养下白黄链霉菌TD-1 VOCs的组分鉴定

由图3可知，共鉴定出60 种主要VOCs，包括酸类、酮类、醇类、醛类、醚类、呋喃类、萜烯类、烷烃类等物质。其中，部分烷烃类物质，包括1,2-环氧庚烷以及二十一烷含量等随着发酵时间的延长、葡萄糖浓度的增加总体降低；醛类物质包括己醛、(Z)-2-庚烯醛、苯甲醛等含量随着发酵时间的延长而降低，然而，随着葡萄糖浓度的增加，部分酮类物质2,3-丁二酮、乙偶姻随着葡萄糖浓度的增加含量逐渐增加；部分醇类物质异丁醇、正己醇、1-辛烯-3-醇、苯乙醇等物质随着发酵时间的延长，含量大体呈现增长趋势，其中1-辛烯-3-醇最为明显；萜烯类物质2-甲基异冰片随着发酵时间的延长含量大体呈现先增加后减少的趋势。随着葡萄糖浓度的增加，醚类物质如苯甲醚、二甲基三硫醚含量随着发酵时间的延长略有增加。在VOCs组分中，乙酸、异丁酸、己醛、甲氧基-苯基肟、1-辛烯-3-醇、3-辛酮、2-正戊基呋喃、2-乙基-1-己醇、2-甲基异冰片、1,4-甲基-1H-环戊哒嗪、6-亚甲基-螺环癸烷、二甲萘烷醇（土味素）、异长叶烯-8-醇、二十一烷等含量较多。乙酸、己醛、1-辛烯-3-醇、2-正戊基呋喃、2-甲基异冰片、苯乙酮均具有一定的抑菌作用[29-32]。其中己醛、1-辛烯-3-醇具有抑制菌丝生长以及孢子萌发的作用，且1-辛烯-3-醇含量与抑制率具有相似的变化趋势，具有作为食品添加剂使用安全的特性。因此，将1-辛烯-3-醇作为起主要抑菌作用的挥发性物质，对其进行抗黄曲霉活性以及对黄曲霉毒素合成调控的深入研究。

图3 白黄链霉菌TD-1发酵过程中VOCs的热图Fig.3 Heatmap showing dynamic changes of VOCs from S.alboflavus TD-1

2.4 1-辛烯-3-醇对黄曲霉产孢能力和生长情况的影响

1-辛烯-3-醇含量梯度为0、5、10、15、20、25 µL/L，对黄曲霉进行抑菌活性测定，结果如表1所示。不同含量1-辛烯-3-醇对黄曲霉生长、产孢抑制率结果如图4所示。在1-辛烯-3-醇含量为5～25 µL/L时，对黄曲霉均具有明显的拮抗作用，生长抑制率在24.94%～100%之间，产孢抑制率在84.50%～100%之间。随着1-辛烯-3-醇含量的增加抑菌活性逐渐增强，15 µL/L时可完全抑制黄曲霉菌的生长及孢子萌发，10 µL/L时其几乎没有孢子，产孢抑制率可达到99.85%，生长抑制率达到75.29%。

图41 -辛烯-3-醇含量对黄曲霉生长、产孢抑制率的影响Fig.4 Inhibitory effects of different concentrations of 1-octen-3-ol on the hyphal growth and spore germination of A.flavus

2.5 1-辛烯-3-醇对黄曲霉微观形态的影响

图51 -辛烯-3-醇对黄曲霉孢子及菌丝体微观形态的影响Fig.5 Conidial morphology and hyphal morphology of A.flavus treated by 1-octen-3-ol

如图5A、B所示，空白组中大部分黄曲霉孢子伸出芽管，孢子形态良好，1-辛烯-3-醇处理组尚无芽管出现并观察到孢子表面有凹陷现象，且孢子数较少，说明1-辛烯-3-醇对黄曲霉孢子有致畸作用，且会抑制黄曲霉孢子的萌发。

如图5C～F所示，预培养2 d黄曲霉菌丝体已经形成孢子囊，生长点较为丰富，且其尖端呈现正常的圆锥形，菌丝体粗细较为均匀、饱满。空白组（处理4 d）的菌丝体形成的孢子囊极多，且有很多成熟的孢子掉落，菌丝体粗细均匀且较为饱满。处理组的菌丝呈现不规则扭曲、干瘪，表面褶皱不平，生长点数量极少，菌丝体较细。说明1-辛烯-3-醇对黄曲霉菌丝体也有明显的致畸作用。

2.6 1-辛烯-3-醇对黄曲霉线粒体膜电位的影响

图61 -辛烯-3-醇对黄曲霉菌丝体罗丹明染色的结果Fig.6 Effect of 1-octen-3-ol on mitochondrial membrane potential of A.flavus

线粒体可为细胞提供能量，与细胞凋亡具有密切关系[33]，罗丹明123是一种可选择性染色活细胞线粒体的荧光染料，可通过细胞膜在活细胞的线粒体内聚集发出黄绿色荧光。荧光强度越弱说明聚集在线粒体内的染料越少，线粒体膜被破坏越严重，ATP合成能力越弱[34]。1-辛烯-3-醇对黄曲霉线粒体膜电位的影响如图6所示，预培养36 h后，菌丝体呈现出明亮的绿色，说明线粒体膜电位正常；培养48 h及60 h空白组的孢子囊增多且较为为明亮；预培养36 h后暴露于1-辛烯-3-醇12、24 h处理组发生了荧光猝灭现象，荧光强度显著降低。由此可知，1-辛烯-3-醇可显著降低黄曲霉线粒体膜电位，减弱黄曲霉线粒体产ATP的能力。

2.7 1-辛烯-3-醇对AFB1生物合成的影响

图71 -辛烯-3-醇对AFB1的抑制作用Fig.7 Inhibitory effect of 1-octen-3-ol on AFB1 production

AFB1的标准曲线为y=11.028x+9.715 6，R2=0.999 9。由图7可知，黄曲霉接种2 d后AFB1含量为19.49 μg/kg；培养至第4天AFB1迅速升高，含量高达67.79 μg/kg，而经过预培养2 d后暴露在1-辛烯-3-醇中2 d，AFB1含量为21.68 μg/kg，相较于空白组，AFB1含量下降了68.02%，黄曲霉产生AFB1量得到了很好地控制，抑制其合成速率达到31.98%。

3 结 论

以白黄链霉菌TD-1为拮抗菌，以黄曲霉为指示菌，研究培养基中葡萄糖浓度对白黄链霉菌TD-1生长和VOCs产量等的影响，在发酵初期，500 mmol/L葡萄糖可抑制白黄链霉菌TD-1的生长，但在发酵后期，葡萄糖慢慢被消耗，6 d后阻遏作用被解除，TD-1开始合成次级代谢产物，在发酵后期，有足够而又不过量的葡萄糖，可对白黄链霉菌TD-1的生长以及次级代谢产物的合成起到明显促进作用，生物量及产生的次级代谢产物VOCs含量较高，产量稳定，其产生的抑菌物质可对黄曲霉菌起到很好的抑制作用。此外，从白黄链霉菌TD-1所产生的挥发性物质中筛选出一种食品级挥发物1-辛烯-3-醇，其对黄曲霉生长有较强的抑制作用，可抑制黄曲霉菌的孢子萌发，破坏细胞膜以及线粒体膜完整性，显著降低黄曲霉菌AFB1的产量。以上研究结果可为微生物源VOCs在食品中的应用提供参考。然而，白黄链霉菌TD-1降低AFB1产量是通过抑制黄曲霉生长还是通过1-辛烯-3-醇调控黄曲霉产毒基因还需进一步研究。