夏枯草酶解水提液分级醇沉及其抗HSV⁃1 活性

张群铄谭红胜 付文卫尚宇婧徐宏喜*

（1.上海中医药大学中药学院，上海201203； 2.上海交通大学医学院，上海 200025）

单纯性疱疹是单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus，HSV）所引起的一种急性疱疹性皮肤病，此病毒终生感染宿主，可引起从简单的口腔和外生殖器溃疡到非常严重的肿瘤和脑炎等一系列疾病［1］。目前临床上的治疗药物以阿昔洛韦等核苷类抗病毒药物为主，但由于长期大量的使用，临床已产生耐药病毒株［2］。因此，开发具有新型抗病毒作用机制的药物来取代或者辅助洛韦类用药迫在眉睫。

徐宏喜等［3⁃5］对300 多种中药进行了系统的抗病毒筛选，首次报道夏枯草水提物具有体外抗HSV⁃1 活性，继而对夏枯草多糖进行了抗HSV 活性的导向分离，获得了分子量分别3 500 和8 500 的2 个多糖组分，初步化学研究显示为木质素多糖复合物；用夏枯草提取物制备的凝胶制剂，体内豚鼠动物模型（HSV⁃1）及小鼠动物模型（HSV⁃2）均有活性，且无细胞毒性；进一步研究发现，夏枯草多糖通过阻止病毒吸附和穿透进入宿主细胞而发挥作用，作用机制与阿昔洛韦的直接杀灭病毒不同［6⁃12］。

目前，多数文献将夏枯草水提醇沉部分默认为夏枯草多糖，其分离方法也多以提高多糖纯度为目标。本实验将夏枯草酶解提取液用乙醇梯度沉淀分段，以抗HSV 活性为导向，尝试寻找夏枯草抗HSV 活性组分，分析各部分成分组成，以期为进一步探寻夏枯草抗HSV 复合多糖构效关系提供研究基础。

1 材料

夏枯草（批号2018052102）购自上海华鹰药业有限公司，经上海中医药大学中药学院生药教研室张红梅副教授鉴定为正品。纤维素酶（批号64001136）、D⁃葡萄糖（批号101330576）、没食子酸（批号20180710）、考马斯亮蓝G⁃250、无水碳酸钠、95%乙醇、苯酚、浓硫酸、磷酸，均购自上海国药试剂有限公司；牛血清蛋白（批号Exp2019103）购自上海泰坦科技股份有限公司；磷钼钨酸试液（上海化科实验器材有限公司）；细胞活力检测试剂盒CCK8（上海李记生物科技有限公司）。

Vero 非洲绿猴肾细胞购自美国模式培养物集存库，货号CCL⁃81；10%胎牛血清100 U／mL 青霉素、100 μg／mL 链霉素（美国Hyclone 公司）；2 mM L⁃谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、1%丙酮酸钠、DMEM 培养液（美国Gibco 公司）。

HSV⁃1 GHSV⁃UL46 株购自美国模式培养物集存库，货号VR⁃1544。

粉碎机、冷冻干燥机（Alpha 2⁃4 LDplus CHRTST）；旋转蒸发仪（RV10DS25 IKA）；CP225D 分析天平（德国Sartorius 公司）；centrifuge 5810R 离心机（德国Eppendorf公司）；SK7200HP 超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；紫外分光光度计（Mapapa P3）；酶标仪SpectraMax M2e（美国Molecular Device 公司）。

2 方法与结果

2.1 夏枯草酶解水提物分级醇沉 取夏枯草果穗，粉碎过2 号筛，取100 g 粉末，加5 g 纤维素酶混匀，加10 倍水于50 ℃搅拌3 h，迅速升温至100 ℃灭活，加10 倍水煎煮2次，每次1.5 h，所得滤液合并浓缩后，依次用20%、30%、40%、50%、60%、70%乙醇醇沉，醇沉液于4 ℃静置12 h 后，4 000 r／min 离心30 min，取沉淀冷冻干燥得各分级醇沉部分（依次为 PVLM⁃1、PVLM⁃2、PVLM⁃3、PVLM⁃4、PVLM⁃5、PVLM⁃6）

2.2 抗HSV⁃1 活性测试 CPE（cytopathic effect）指病毒在宿主细胞内大量增殖，导致细胞病变甚至死亡的现象，通过检测细胞活力，CPE 实验被广泛用于化合物对可引起细胞病变的病毒的抑制活性测定［13］。本研究应用该实验，采用Vero 细胞、GHSV⁃UL 46 病毒株、CCK8 检测试剂、Acyclovir 阳性对照，化合物处理5 d／终点法，检测受试样品对HSV⁃1 的体外抑制活性。

将Vero 细胞以每孔10 000 个细胞的浓度接入96 孔细胞培养板中，并于5% CO2、37 ℃培养箱中培养过夜。第2天分别加入受试样品／阳性对照化合物和病毒（MOI ＝0.02）。细胞培养液中的DMSO 终浓度为0.5%。细胞在37 ℃、5% CO2条件下继续培养5 d 至病毒对照孔（细胞感染病毒，无化合物处理）内细胞病变率达到80%～95%。细胞毒性实验与抗病毒实验同时进行测试，实验条件一致，但无病毒感染。

使用细胞活力检测试剂CCK8 检测细胞活力。受试样品的抗病毒活性和细胞毒性分别由受试样品对病毒引起的细胞病变效应的抑制率和细胞活率表示。计算公式如下。

使用GraphPad Prism（version 5）软件对受试样品的抑制率和细胞活率进行非线性拟合分析，得到受试样品的EC50和CC50值。

结果显示，受试样品PVLM⁃1、PVLM⁃2、PVLM⁃6 对HSV⁃1 具有抑 制活性，EC50值分别 为60.79、42.45、101.70 μg／mL；其他受试样品在测试浓度内没有显示出抗病毒活性，EC50值为大于最高检测浓度＞250 μg／mL。

受试样品在测试浓度内对Vero 细胞没有显示出细胞毒性，CC50值为大于最高检测浓度＞250 μg／mL。见表1。

表1 夏枯草酶解水提物各梯度乙醇沉淀抗HSV⁃1 活性（μg／mL）

2.3 成分分析 结果见表2。

表2 夏枯草酶解水提物各梯度乙醇沉淀成分组成（%）

2.3.1 多糖含量测定 采用硫酸⁃苯酚法［14］，以葡萄糖为对照品，在490 nm 波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标（A），质量浓度为横坐标（X）进行回归，得方程A＝24.674X－0.3462（r＝0.999 0），在5.034～50.34 μg／mL范围内线性关系良好。

2.3.2 蛋白质含量测定 采用考马斯亮蓝法［15］，以牛血清蛋白为对照品，于595 nm 波长处测定其吸光度。以吸光度为纵坐标（A），质量浓度为横坐标（X）进行回归，得方程A＝22.611X－0.259 7（r＝0.997 4），在1.687～16.867 μg／ mL范围内线性关系良好。

2.3.3 多酚含量测定 采用Folin⁃Ciocalteu 法［16］，以没食子酸为对照品，在760 mn 的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标（A），质量浓度为横坐标（X）进行回归，得方程A＝10.048X－0.009 8（r＝0.999 9），在2.08～20.80 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.4 夏枯草酶解水提液30%醇沉部分多糖的纯化及其活性测试

2.4.1 夏枯草抗HSV 活性部位制备 取夏枯草果穗，粉碎过筛，取粉末100 g，加5 g 纤维素酶混匀，加10 倍水于50 ℃搅拌3 h，迅速升温至100 ℃灭活，加10 倍水煎煮2次，每次1.5 h，所得滤液合并浓缩后，加无水乙醇至醇浓度30%，于4 ℃静置12 h 后，4 000 r／min 离心30 min，取沉淀冷冻干燥，即得。

2.4.2 柱色谱前处理 大孔树脂D301 用95% 乙醇浸泡12 h后湿法装柱，用95% 乙醇冲洗层析柱（体积流量2 BV／ h，BV 为树脂体积数，下同），至流出液加2 倍蒸馏水后不产生浑浊为止，再用大量蒸馏水洗至流出液澄清，继续洗脱2～3 BV；HCl 溶液洗层析柱（体积流量4～6 BV／h），并浸泡2～3 h，再用蒸馏水以同样的体积流量洗至中性，用2～3 BV 4%NaOH 溶液洗层析柱（体积流量4～6 BV／h），浸泡2～3 h 后，再用蒸馏水以同样的体积流量洗至中性。

2.4.3 柱色谱纯化过程 取“2.4.1”项下夏枯草抗HSV活性部位适量，制备成质量浓度为0.3 mg／mL 的上样液，以料液⁃填料1 ∶50 的比例上样，首先用蒸馏水作流动相，5 mL 为一流分，用自动接收器接收，每一流分用浓硫酸⁃5%苯酚进行显色，收集显色者，浓缩，冻干，进行含量测定及抗HSV⁃1 活性检测。再用1 mol／L NaCl 溶液作流动相，以5 mL 为一流分，用自动接收器接收，每一流分用浓硫酸⁃5%苯酚进行显色，收集显色者，3 kD 超滤离心管离心，1% AgCl 溶液检测，去除NaCl 至无沉淀产生，冻干，按“2.3”项下方法测定多糖、蛋白质、多酚含量，按“2.2”项下方法进行体外抗HSV⁃1 活性检测。结果见表3。

表3 夏枯草多糖及其他成分含量、活性测定结果

3 讨论

纤维素酶解可通过酶水解破碎植物细胞壁的作用，使细胞内多糖物质充分溶出，从而提高药用成分的提取率［16⁃17］。纤维素酶水解过程中应注意温度不能过高，酶解后需立即升温灭活。应用CPE 试验，对夏枯草酶解水提液各梯度乙醇沉淀进行抗HSV 活性筛选，发现20% 及30%乙醇的沉淀具有良好的抗HSV⁃1 活性，其ED50分别为60.79、42.45 μg／mL，40%乙醇及以上的分级沉淀无活性或有较弱的活性；经大孔树脂D301 纯化后的夏枯草多糖，纯度可达77.78%，但其抗HSV 活性反而丧失。通过对各部分分级醇沉及经大孔树脂D301 纯化后的夏枯草多糖进行各类成分分析发现，多糖含量的高低与其抗HSV 活性强弱并不呈现正相关，反而蛋白质及多酚类成分的去除会消除相应成分的抗HSV 活性，其构效关系有待进一步探究。