连花清瘟胶囊微生物限度检查方法的建立

张秀花，刘艳平，任仲丽，曲国晶

（菏泽市食品药品检验检测研究院，山东 菏泽 274000）

连花清瘟胶囊收载于《中国药典》 一部［1］，由连翘、金银花、板蓝根等13 味中药加工而成，方中连翘、金银花等具有抗菌作用［2⁃3］，治疗细菌性肺炎和急性上呼吸道感染取得了良好效果［4⁃6］，2020 年4 月它被批准用于治疗新冠肺炎。目前，全球疫情蔓延，严重威胁人类健康，故连花清瘟胶囊的质量倍受关注。

为了保证临床用药安全，各国药典对口服制剂的微生物污染状况都有明确质控指标［7⁃11］。在原辅料、生产工艺、设施环境等可控的条件下，微生物污染菌的检出主要体现在实验室检测环节上，开展方法学适用性试验是做好微生物限度检查的重点和关键环节。本实验通过各试验菌回收比及控制菌检查方法试验，建立了连花清瘟胶囊微生物限度检查方法，以期为该制剂质量控制提供依据。

1 材料

1.1 药物 连花清瘟胶囊购自石家庄以岭药业股份有限公司，批号A1908063、A2001273、A2001105。

1.2 培养基、稀释液 胰酪大豆胨琼脂培养基TSA（批号190518）、沙氏葡萄糖琼脂培养基SDA（批号190625）、胰酪大豆胨液体培养基TSB（批号190712）、pH7.0 无菌氯化钠⁃蛋白胨缓冲液（批号190206）均由北京陆桥技术股份有限公司提供。

1.3 菌种 金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］、铜绿假单胞菌 ［CMCC（B）10104］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、黑曲霉［CMCC（F）98003］、大肠埃希菌［CMCC（B）44102］均由广东环凯微生物科技有限公司提供，经专家鉴定合格，而且均为第3 代。

1.4 仪器 电子天平（HZT⁃A600，福州华志科学仪器有限公司）；高压蒸汽灭菌器（mlS⁃3781L⁃PC，三洋工业株式会社）；生物安全柜（ClassⅡBSC，新加坡ESCD 公司）、细菌浊度分析仪（WGZ⁃2XJ，上海盺瑞仪器仪表有限公司）；电热恒温培养箱（DHP⁃420，北京市永光明医疗仪器厂）。

2 方法

2.1 菌液制备 按文献［12］ 报道，将“1.3”项下菌种制成浓度不大于10 000 cfu／mL 的菌悬液，即得。

2.2 供试液制备 按文献［12⁃13］ 报道，将“1.1”项下样品依次按1 ∶10、1 ∶20、1 ∶50 比例稀释，即得。

2.3 计数方法适用性试验

2.3.1 常规法 取“2.1”项下菌液0.1 mL，加到“2.2”项下1 ∶10 供试液9.9 mL 中，混匀，作为试验组；取稀释液0.1 mL，加到“2.2”项下1 ∶10 供试液9.9 mL 中，混匀，作为供试品组；取“2.1”项下菌液0.1 mL，加到稀释液9.9 mL中，混匀，作为菌液对照组。取上述试液各2 mL注皿（1 mL／皿），加入15～20 mL 温度不超过45 ℃熔化的TSA 或SDA 培养基，混匀，凝固，倒置培养，计算平均菌落数。

2.3.2 增加稀释液法 取“2.1”项下菌液0.1 mL，分别加到“2.2”项下1 ∶20、1 ∶50 供试液9.9 mL 中，混匀，作为试验组，其他同“2.3.1”项，取2 mL 注皿（1 mL／皿），加入15～20 mL 温度不超过45 ℃熔化的TSA 或SDA 培养基，混匀，凝固，倒置培养，计算平均菌落数。

2.3.3 增加培养基体积法 取“2.1”项下菌液0.1 mL，加到“2.2”项下1 ∶10 供试液9.9 mL 中，混匀，作为试验组，其他同“2.3.1”项，取1 mL 注皿（0.5、0.2 mL／皿），加入15～20 mL 温度不超过45 ℃熔化的TSA 或SDA 培养基，混匀，凝固，倒置培养，计算平均菌落数。

2.3.4 增加稀释液⁃增加培养基体积联合法 取“2.1”项下菌液0.1 mL，加到“2.2”项下1 ∶20、1 ∶50 供试液9.9 mL 中，混匀，作为试验组，其他同“2.3.1”项，分别取1、2 mL 注皿（0.2、0.4、0.5 mL／皿），加入15～20 mL温度不超过45 ℃熔化的TSA 或SDA 培养基，混匀，凝固，倒置培养，计算平均菌落数。

2.4 回收比计算 公式为试验组回收比＝（试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数）／菌液对照组平均菌落数、稀释剂对照组回收比＝稀释剂对照组平均菌落数／菌液对照组平均菌落数。

3 结果

3.1 预试验 在文献［14⁃21］ 基础上，首先采用常规法进行预实验，测定5 种菌株回收比，按“2.3.1”项下方法操作，结果见表1。由此可知，常规法3 批样品中枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌回收比均小于0.5，表明对这2 种菌株均有较强抑制作用，可作为需氧菌总数计数方法测定的敏感菌株；霉菌酵母菌计数时，各试验菌回收比均在0.5～2.0 范围内，符合《中国药典》 要求，可采用常规法进行检查。

表1 常规法预试验结果（n＝3）

3.2 需氧菌计数方法确定 根据“2.3.1”项下结果，选用枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌作为敏感菌株，按“2.3.2”至“2.3.4”项下方法操作，结果见表2～3。由此可知，稀释倍数不同，敏感菌株回收比有显著差异；增加稀释液法1 ∶20（1 mL／皿）、增加培养基体积法1 ∶10（0.5 mL／皿）供试液中样品浓度相同，稀释倍数为20 倍，枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌回收比均小于0.5，表明该浓度下供试液仍具有一定抑菌性；增加稀释液法1 ∶50（1 mL／皿）、增加培养基体积法1 ∶10（0.2 mL／皿）、增加稀释液⁃增加培养基体积联合法1 ∶20（0.4 mL／皿）供试液中样品浓度相同，稀释倍数为50 倍，枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌回收比均在0.5～2.0 范围内，表明该浓度下供试液抑菌作用已消除；增加稀释液⁃增加培养基体积联合法1 ∶20（0.2 mL／皿）、1 ∶50（0.5 mL／皿）供试液中样品浓度相同，稀释倍数为100 倍，枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌回收比均在0.5～2.0 范围内，表明该浓度下供试液抑菌作用已消除，与稀释倍数为50 倍时各试验菌回收比基本一致。最终，选择稀释倍数50 倍时增加稀释液法1 ∶50（1 mL／皿）、增加培养基体积法1 ∶10（0.2 mL／皿）、增加稀释液⁃增加培养基体积联合法1 ∶20（0.4 mL／皿）进行需氧菌计数方法试验。

表2 枯草芽孢杆菌回收比试验结果（n＝3）

表3 金黄色葡萄球菌回收比试验结果（n＝3）

3.3 正式试验 根据“3.1”和“3.2”项下结果，需氧菌计数按“2.3.2”至“2.3.4”项下方法操作，霉菌酵母菌计数按“2.3.1”项下方法操作，结果见表4～5，可知3批样品5 种菌株回收比均在0.5～2.0 范围内，符合《中国药典》 要求［12］。最终确定，需氧菌总数测定可采用增加稀释液法，1 ∶50 供试液注皿（1 mL／皿），也可采用增加培养基体积法，1 ∶10 供试液注皿（0.2 mL／皿）；霉菌酵母菌总数测定可采用常规法，1 ∶10供试液注皿（1 mL／皿），此时各试验菌回收比均符合 《中国药典》 要求，方法可行。

表4 连花清瘟胶囊方法适用性试验结果Ⅰ（n＝3）

3.4 控制菌检查

3.4.1 常规法 取“2.2”项下1 ∶10 供试液10 mL，加到100 mL TSB 中，混匀，作为供试品组；取“2.2”项下1 ∶10 供试液10 mL、“2.1”项下大肠埃希菌0.1 mL，加到100 mL TSB 中，混匀，作为试验组；取稀释液10 mL，加到100 mL TSB 中，作为阴性组，按照文献［12］ 报道的方法检查。结果见表6。

表5 连花清瘟胶囊方法适用性试验结果Ⅱ（n＝3）

3.4.2 稀释法 取“2.2”项下1 ∶20 供试液10 mL，加到100 mL TSB 中，混匀，作为供试品组；取“2.2”项下1 ∶20 供试液10 mL、“2.1”项下大肠埃希菌0.1 mL，加到100 mL TSB 中，混匀，作为试验组；取稀释液10 mL，加到100 mL TSB 中，混匀，作为阴性组，按照文献［12］报道的方法检查。取“2.2”项下1 ∶50 供试液依法操作，结果见表6。

表6 控制菌方法适用性试验结果

3.4.3 结果分析 常规法、稀释法均检出阳性菌，而阴性组均无菌落生长，表明可用常规法进行控制菌的检查。

4 讨论

微生物限度检查是评价药品安全性的重要手段，是对药品中已有微生物污染菌的再现，也是客观衡量药品质量的重要指标，其操作过程受人、机、料、法、环等诸多因素影响，工作量大、重复劳动多［19⁃20，22⁃23］。因此，对同一品种建立合理有效的适用性试验尤其重要。

研究表明，连花清瘟胶囊具有抑菌活性，故进行微生物限度检查时必须首先消除样品本身上述作用，这样才能保证被检微生物正常生长繁殖［2］。表1 显示，连花清瘟胶囊对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，故分别采用增加稀释液法、增加培养基体积法及二者联合法进行方法适用性试验。由表2～5 可以看出，稀释倍数不同，敏感菌株回收比有显著差异；当供试液中样品浓度相同时，3 种方法下样品抑菌活性大致相同；当稀释倍数为20 倍时，枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的回收比均小于0.5，仍具有一定的抑菌性；当样品的稀释倍数为50 倍时，两者回收比均在0.5～2.0 范围内，表明抑菌性已去除。在控制菌检查中，用2 种方法、3 个浓度进行适用性试验，结果均检出阳性菌，表明样品对控制菌无抑制作用，可用常规法进行检查。

研究表明，3 种方法均适用于连花清瘟胶囊微生物限度检查，但对抗菌活性的去除效果略有不同。表2～5 显示，当供试液稀释倍数相同时，去除效果依次为增加培养基体积法＞二者联合法＞增加稀释液法，可能是由于增加培养基体积法注皿时每皿中样品量最低，从而抗菌活性去除效果最好，各试验菌回收比最高，而且该方法操作简单，重复性好，结果准确可靠［24⁃27］，与生产企业前期研究结果［2，28］一致，适用于连花清瘟胶囊微生物限度检查。