慢性束缚应激对小鼠攻击行为的影响及机制探讨

陈子衿,刘明妮,董莹莹,马文强,赵茹茜

(南京农业大学农业农村部动物生理生化重点实验室/动物医学院,江苏 南京 210095)

应激是指动物机体在受到各种内外环境刺激时表现的非特异性反应的总和[1-2]。畜禽生产过程中存在很多应激源,这些应激源都会对畜禽生产性能产生影响。研究发现,热应激能减少猪的采食并导致日增重下降,生长发育受阻[3-4]。热应激也会严重影响蛋鸡的生产能力,导致饲料利用率下降,产蛋率降低[5-6]。长期处于免疫应激状态会导致动物食欲减退,免疫功能下降,生产性能降低[7]。集约化养殖环境中的众多应激源会抑制动物生长,诱发疾病,严重损害畜禽生产性能。

应激不仅会影响畜禽的生产性能,而且会影响畜禽自然行为的发生。Meunier-Salaun等[8]报道当生长育肥猪处于狭小的环境时(2.94头/m2),会减少猪群间的社交行为。束缚应激会显著增加新扬州鸡的刻板行为和反抗行为,并且降低鸡采食量和产蛋效率[9]。用应激激素皮质酮处理的鸡胚,孵化后其攻击行为明显增加[10]。攻击行为属于社会行为的一种,但蓄意的攻击行为以及身体冲突对受害者和侵略者都是潜在的危害[11-12]。与攻击行为相关的脑神经回路由多个区域组成,包括前额皮质、杏仁核、海马、下丘脑以及其他相互交联的结构[13]。与攻击行为相关的神经递质主要包括5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)和多巴胺(dopamine,DA)[14-15]。5-HT是调节雄性间攻击行为的主要神经递质[16],低含量的5-HT与冲动型攻击行为有关[17],使用5-HT激动剂能够降低啮齿类动物的攻击性[18-19]。DA是一种由下丘脑合成和分泌的儿茶酚胺类神经递质,储存于多巴胺能神经元中[20]。DA同样参与攻击行为,DA受体拮抗剂能显著减少雄性小鼠间的攻击行为[21]。

慢性束缚应激是一种非损伤性的心理应激方式,可模拟动物机体所处的应激状态。本试验采用慢性束缚应激方式来建立束缚应激模型,探讨束缚应激对小鼠攻击行为和5-HT、DA分泌及其相关基因和蛋白质的影响,并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验仪器与试剂

1.1.1 试验仪器光敏摄像机(DCRA-C155,Sony),冷冻离心机(AllegraTM64R,USA),超声波破碎仪(Vcx130,Sonics),匀浆仪(MS-100R,TOMY),全波长多功能酶标仪(Synergy2,BioTek),Real-time PCR仪(Mx3000,Stratagene),核酸定量仪(Nanodrop ND-1000,Stratagene),蛋白质电泳仪(Min P4,BIO-RAD),凝胶成像系统(VersaDoc 4000MP,BIO-RAD)等。

1.1.2 试验试剂Trizol(上海普飞),反转录试剂盒(D6110A,南京诺唯赞),BCA总蛋白测定试剂盒(南京生兴),实时荧光定量PCR试剂盒(大连TaKaRa),皮质酮ELISA试剂盒(ADI-900-097,ENZO),5-HT(H104)、DA(H170)、去甲肾上腺素(norepinephrine,NE,H096)ELISA试剂盒(南京建成)。

1.2 试验方法

选取52只7周龄C57BL/6J雄性小鼠,随机分为对照组(control group,Con)和慢性束缚应激组(chronic restraint stress group,RS);另选取7周龄雄性及雌性小鼠各12只,配对饲养,同样分为2组(对照组和慢性束缚应激组),其中雄性小鼠作为驻留者用于攻击行为评测,雌性小鼠不做任何处理,仅作陪伴公鼠用;此外,选取12只6周龄雄性小鼠作为入侵者用于攻击行为评测。适应期7 d结束后,慢性束缚应激组小鼠连续7 d,每天束缚6 h(09:00—15:00);对照组小鼠在此期间禁食禁水,其余时间未做处理;雌性小鼠和入侵者在试验期间未做任何处理。试验结束后,对照组和慢性束缚应激组各取12只小鼠(驻留者)进行攻击行为试验,其余小鼠麻醉后眼球采血,血液样品以3 000 r·min-1离心10 min,分离血浆后放入-20 ℃冰箱备用。小鼠全身消毒后剪下鼠头,迅速分离下丘脑及脑干,快速置于液氮后贮存于-80 ℃备用。

1.3 测定指标

1.3.1 生长性能测定记录小鼠8周龄初始体重及9周龄终末体重。

1.3.2 小鼠争斗行为评测在行为测试时,提前1 h将雌性小鼠从驻留者笼中拿出,将入侵者放入驻留者的鼠笼里,开始计时。采用录像机对动物行为进行录像,时间为20 min。由观察者分析第1次攻击的潜伏期(latency to the first bite,LB)和驻留者对入侵者的总攻击次数(total number of attacks,NA)以及总攻击时间(total duration of attack manifestations,DAM)[22]。争斗行为包括侧身威胁、追赶、尾巴竖起、防御性直立姿势和攻击咬伤[23-24]。综合评分(compasite aggression score,CAS)计算公式[25]:CAS=NA+0.2×LB+0.2×DAM。

1.3.3 血浆和下丘脑皮质酮及神经递质含量的测定用相应ELISA检测试剂盒分别检测血浆皮质酮、5-HT、DA、NE和下丘脑中5-HT、DA的含量。

1.3.4 RT-qPCR检测下丘脑攻击行为相关基因表达称取约40 mg下丘脑组织,用Trizol试剂提取总RNA,分光光度法测定RNA浓度后,反转录合成cDNA,然后用RT-qPCR检测下丘脑攻击行为相关基因的表达。PCR反应程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s;60 ℃ 30 s;95 ℃ 15 s;60 ℃ 60 s;95 ℃ 15 s。攻击行为相关蛋白基因:乙醛脱氢酶基因(acetaldehyde dehydrogenase gene,Aldh)、儿茶酚胺氧位甲基转移酶基因(catechol-O-methytransferase gene,Comt)、多巴胺转运体基因(dopamine transporter gene,Dat)、多巴脱羧酶基因(dopa decarboxylase gene,Ddc)、多巴胺受体基因(dopamine receptor D gene,Drd)、5-HT转运体基因(5-hydroxytryptamine transporter gene,5-Htt)、5-HT受体基因(5-hydroxytryptamine receptor gene,5-Htr)、色氨酸羟化酶基因(tryptophan hydraxylase gene,Tph)、单胺氧化酶基因(monoamine oxidase gene,Mao)、酪氨酸羟化酶基因(tyrosine hydroxylase gene,Th)以及囊泡单胺类转运体基因(vesicular monoamine transporter gene gene,Vmat),内参基因为18SrRNA、β-actin以及Tubulin-α。以对照组目的基因的表达为基准,用2-ΔΔCT法计算各目的基因相对表达量。引物由南京擎科生物工程有限公司合成。引物序列见表1。

表1 本试验实时荧光定量PCR所用引物Table 1 Primers used for real-time fluorescence quantitative PCR in this study

1.3.5 Western blot检测下丘脑攻击行为相关蛋白的表达小鼠下丘脑样品用蛋白裂解液RIPA处理后,采用BCA法测定蛋白浓度,而后蛋白样本加入上样缓冲液,95 ℃水浴10 min,置于-80 ℃冰箱备用。选取GAPDH蛋白为内参,经过SDS-PAGE,转印硝酸纤维膜,封闭(40 g·L-1脱脂奶粉,2 h)后,加一抗4 ℃孵育过夜,加TBST缓冲溶液振荡清洗(10 min,3次),用辣根氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h,再次加TBST洗膜后进行显影,凝胶成像系统检测目的蛋白条带灰度值。以目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值比值表示目的蛋白相对表达量。攻击行为相关蛋白抗体信息:VMAT2(sc-374079)、MAOB(df6464)、TPH2(sc-61700-pr)、DRD1(DF7097)、DAT(DF2243)、GAPDH(mkr227a)、兔二抗(BS10043)、鼠二抗(BS12478)。

1.4 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 慢性束缚应激处理对小鼠生长性能的影响

如表2所示:与对照组相比,束缚应激组极显著降低小鼠终重和平均日增重(P<0.01),且显著降低小鼠的平均日采食量(P<0.05)。

表2 慢性束缚应激处理对小鼠生长性能的影响Table 2 Effects of chronic restraint stress treatment on growth performance of mice

2.2 慢性束缚应激处理对小鼠攻击行为的影响

如表3所示:在20 min的行为观测期内,与对照组相比,束缚应激显著缩短小鼠攻击潜伏期时间(P<0.05),显著增加小鼠总攻击次数(P<0.05)。

表3 慢性束缚应激对小鼠攻击行为的影响Table 3 Effects of chronic restraint stress on aggressive behavior of mice

2.3 慢性束缚应激处理对小鼠血浆和下丘脑神经递质水平的影响

如表4所示:与对照组相比,束缚应激显著提高小鼠血浆皮质酮含量(P<0.05),对小鼠血浆5-HT、DA及NE水平没有显著影响。此外,束缚应激对小鼠下丘脑5-HT和DA的水平也没有显著影响。

表4 慢性束缚应激处理对小鼠血浆和下丘脑神经递质水平的影响Table 4 Effects of chronic restraint stress on plasma and hypothalamic neurotransmitters in mice ng·mL-1

2.4 慢性束缚应激处理对小鼠下丘脑5-羟色胺代谢相关基因的影响

如图1所示:与对照组相比,束缚应激组显著提高小鼠下丘脑中Vmat2、5-Ht1br及Aldh1a1mRNA水平(P<0.05)。

图1 慢性束缚应激对小鼠下丘脑中5-羟色胺代谢相关基因的影响Fig.1 Effects of chronic restraint stress(RS)on genes related to 5-HT metabolism in mice hypothalamus

2.5 慢性束缚应激处理对小鼠下丘脑多巴胺代谢相关基因的影响

如图2所示:与对照组相比,束缚应激组显著提高小鼠下丘脑中Vmat2、Ddc及Drd2mRNA水平(P<0.05),且极显著提高DatmRNA水平(P<0.01)。

图2 慢性束缚应激对小鼠下丘脑中多巴胺代谢相关基因的影响Fig.2 Effects of chronic restraint stress on genes related to DA metabolism in mice hypothalamus

2.6 慢性束缚应激对小鼠下丘脑攻击行为相关蛋白的影响

如图3所示:与对照组相比,束缚应激组极显著降低小鼠下丘脑DAT蛋白水平(P<0.01)。

图3 慢性束缚应激对小鼠下丘脑攻击行为相关蛋白的影响Fig.3 Effect of chronic restraint stress(RS)on hypothalamic aggression-related proteins in mice

3 讨论

应激可降低动物的生长性能。研究发现,免疫应激和热应激可降低肉鸡饲料利用率,抑制生长[26-27]。饲养密度增大可显著增加仔猪攻击行为次数,降低仔猪日采食量和日增重[28]。应激类激素地塞米松处理可抑制大鼠采食,降低体重[29]。本试验结果显示,慢性束缚应激同样可显著降低小鼠采食量,并减少小鼠体重。动物机体基础代谢率会随着攻击行为的发生而增加[30]。慢性束缚应激对小鼠的生长抑制可能与摄食抑制及能量支出增加有关。

应激可影响动物的攻击行为。研究报道,与对照组相比,减牙和断尾处理的仔猪表现出更多的攻击行为[31]。用孤养、昼夜颠倒、非奖赏性挫败等多种持续性应激方法处理的大鼠攻击次数、屈服后继续攻击与攻击/威胁比这3项指标存在显著性差异[32]。与对照组相比,雄性金苍鼠每天注射0.4 μg·g-1地塞米松,对入侵者攻击次数显著增多[33]。本试验结果显示,束缚应激缩短小鼠攻击的潜伏期时间,显著增加总的攻击次数。

5-HT和DA系统参与调控动物争斗行为。研究发现,高攻击性的小鼠其前额叶皮质内 5-HT 水平较低[34],且运输应激可降低大鼠中枢神经系统部分脑区5-HT水平[35]。单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)主要降解去甲肾上腺素和5-HT,而单胺氧化酶A(monoamine oxidase A,MAOA)敲除后,幼鼠脑内5-HT含量增加9倍,小鼠成年后表现出明显的攻击行为[36]。研究表明,反复经历社会失败应激模型的大鼠中缝核MaoamRNA水平显著升高[37]。与对照组相比,心理应激大鼠的黑质和腹侧被盖区的DA水平增加[38]。本试验结果显示,慢性束缚应激对小鼠血浆及下丘脑5-HT及DA水平没有影响,但显著降低小鼠下丘脑DAT蛋白表达。DAT能够转运DA,使DA更多停留在突触间隙,停止DA的生物学效应,对DAT的阻断会增加成年小鼠的攻击行为[39]。慢性束缚应激对小鼠争斗行为的影响与下丘脑DAT表达抑制密切相关。

本试验结果显示:慢性束缚应激可显著降低小鼠体重和采食量,增加其攻击行为,极显著降低小鼠下丘脑DAT蛋白表达。