蔷薇科果树CLE多肽家族的鉴定及梨PbrCLE31调控花粉管生长功能分析

程梦雨,李小强,王鹏,张华,张绍铃,吴巨友,3*

(1.南京农业大学园艺学院/作物遗传与种质创新国家重点实验室,江苏 南京 210095;2.上海农林职业技术学院,上海 201699;3.江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室,江苏 南京 210014)

多肽激素对植物生长发育以及胁迫反应均具有重要的调节作用[1-2]。CLE(CLAVATA3/Embryo surrounding region)是最大的植物多肽激素家族之一,其参与植物细胞间交流,特别是在茎尖分生组织、根顶端分生组织和维管形成层中参与维持细胞增殖与分化的平衡[3]。CLE多肽家族结构特征鲜明,其N端为信号肽,中间为可变域,C端为保守结构域,其中,保守结构域的氨基酸长度为12～14,称为CLE基序或CLE结构域[4]。除了典型的三重域外,有些CLE基因还包括1个称为C端延伸的第4域,但该结构域并不是高度保守[5]。

迄今为止,已在拟南芥[6]、杨树[7]、番茄[8]、葡萄[9]、小麦[10]、大豆[11]和棉花[12]等多个物种中鉴定并分析了CLE多肽家族。拟南芥有32个CLE基因,根据功能分为4类。Group-A可抑制顶端分生组织的发育和木质部导管细胞的分化;Group-B可以抑制分生组织活性;Group-C成员可促进木质部导管细胞的分化;Group-D的作用尚不清楚[13]。除了植物之外,在囊线虫中也发现了CLE基因[14],其可以利用宿主细胞产生有功能的CLE多肽,进一步促进线虫感染宿主植物[15-16]。

蔷薇科果树包括梨、苹果、桃等,在果树中占有极重要的地位,但蔷薇科果树中关于CLE多肽家族的相关研究尚未见报道。随着基因组测序的完成,在梨等蔷薇科果树中研究基因家族信息成为可能,因此本研究基于6个蔷薇科物种的全基因组数据共鉴定出91个CLE基因,通过生物信息学方法探讨其基本特性和进化特征,并通过转录组数据以及荧光定量分析研究梨CLE基因在各组织以及花柱和花粉不同发育阶段的表达情况;同时合成梨PbrCLE31多肽,检测其对花粉管生长的调控作用,旨在为阐明PbrCLE31的功能及其分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试品种为梨全基因组测序品种‘砀山酥梨’,种植于南京农业大学白马教学科研基地。开花前2 d采集梨花粉,室温自然散粉后放入硫酸纸袋-20 ℃干燥保存;花柱保存于-80 ℃冰箱。

1.2 蔷薇科CLE家族的筛选和鉴定

从TAIR10(http://www.arabidopsis. org)中下载拟南芥32个CLE多肽序列。利用AtCLE的多肽序列对6个蔷薇科物种蛋白序列进行BLASTp搜索,并根据32个AtCLE的多肽序列,建立隐马尔可夫模型(Hidden Markov Model,HMM);使用HMMER 3软件[17]对蔷薇科果树的蛋白数据库进行HMM搜索。从梨数据库(http://peargenome.njau.edu.cn)下载梨(Pyrusbretschneideri)的基因组序列。苹果(Malusdomestica)、桃(Prunuspersica)、草莓(Fragariavesca)和黑树莓(Rubusoccidentalis)的基因组序列信息从蔷薇科基因组数据库(http://www.Rosaceae.org)中下载。梅(Prunusmume)基因组序列从梅基因组数据库(http://prunusmumegenome. bjfu.edu.cn/index.jsp)获取。检索到的所有候选基因的序列均用作迭代查询,去除没有CLE基序的候选基因,最终确定CLE基因。

1.3 蔷薇科CLE家族生物信息学分析

通过在线预测工具Sequence Manipulation Suite(https://www. genscript. com/sms2/index. html)预测6个蔷薇科物种CLE的蛋白相对分子质量和等电点,输入多肽序列,并保留默认参数提交。使用MEGA X[18]构建系统发育树,用Clustal W程序比对6个蔷薇科物种和拟南芥的所有CLE全长多肽序列,使用最大似然法(maximum likelihood,ML)构建无根系统发育树,bootstrap 值设置为1 000。从每个物种的基因组注释文件中获得CLE多肽家族成员的染色体位置信息和相关基因对信息,然后使用TBtools软件[19]绘制CLE基因在染色体上的位置和共线性对,不包括位于scaffolds的基因。利用MEME[20]对CLE基因的保守基序进行分析,参数中基序的最大值设置为5,基序长度设置为6～50。利用GSDS 2.0[21]分析CLE基因的结构。采用PGDD[22]分析CLE基因重复事件,采用MCScanX[23]识别不同的重复事件。使用TBtools软件通过邻接(NG)法来计算同源基因对的非同义替代率(Ka)和同义替代率(Ks),根据Ks值计算进化时间(T=Ks/2k,k值为1.5×10-9)[24];根据Ka/Ks值确定其在演化过程中的选择方式,当Ka/Ks>1时为阳性选择,Ka/Ks=1时为中性选择,Ka/Ks<1时为纯化选择[25]。

1.4 梨PbrCLE基因的表达模式分析

转录组数据从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中下载。‘砀山酥梨’不同组织(茎、叶、子房、果实、芽、花瓣、萼片)、不同花柱(未授粉花柱、异交授粉花柱和自交授粉花柱)以及不同花粉发育阶段的转录组数据均来自文献[26-28]。将基因表达量数据通过log2归一化后使用TBtools软件将表达结果可视化。

1.5 多肽合成及处理花粉管

合成的梨CLE多肽购于杭州丹港生物科技有限公司,合成的多肽序列如下:PbrCLE3,KRQVPTGPNPLHS;PbrCLE7,KRQVLRGPDSKHG;PbrCLE12,KRKVGRGSDPIHN;PbrCLE24,DRRVPGGPDSQHH;PbrCLE31,AHEVPSGPNPISN,其纯度分别为96.82%、96.93%、96.83%、96.90%和96.85%。将合成的多肽稀释至10 mmol·L-1作为母液,在198 μL花粉培养基中加入2 μL多肽母液,使花粉培养基中CLE多肽质量浓度为100 μmol·L-1,以不含多肽的花粉培养基处理花粉作为对照,每个处理重复3次。同时,分别用1 和100 μmol·L-1PbrCLE31处理花粉。花粉培养基配方参照文献[2]。花粉管培养3 h后用显微镜拍照并记录,使用Image-Pro Plus6.0(http://www. mediacy.com)软件测量花粉管的长度。

1.6 CLE基因相对表达量的检测

使用RT-qPCR方法检测样品中CLE基因的相对表达量。采用多糖多酚植物RNA提取试剂盒(成都福际生物技术有限公司)提取RNA,采用反转录试剂盒 RevertAid 1st cDNA Synth Kit(Thermo Fisher Scientific,Massachusetts,USA)进行反转录,合成的cDNA用于RT-qPCR分析。使用NCBI引物设计工具Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih gov/tools/primer-blast)设计基因特异性引物(表1),并在梨基因组中进行特异性检验。反应体系(10 μL):0.2 μL cDNA模板,2.5 μL正、反引物预混液(0.05 μmol·L-1),5 μL 2×SYBR Green Master Mix(Roche)和2.3 μL ddH2O。反应程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 3 s,60 ℃ 10 s,72 ℃ 30 s,共55个循环。梨的内参基因使用PbrUBQ。采用2-ΔΔCT方法计算基因相对表达量,采用Excel 2016进行图表绘制和统计分析。

表1 用于RT-qPCR分析的引物序列Table 1 Oligonucleotide sequences for primers used in RT-qPCR

2 结果与分析

2.1 蔷薇科果树中CLE基因的鉴定和分类

使用已报道的拟南芥32个CLE多肽序列作为参照,筛选出蔷薇科6个物种的CLE候选基因。同时使用MEME(http://meme-suite.org)从蔷薇科候选CLE中识别出保守的CLE基序。参考葡萄CLE基因成员的筛选条件,根据候选CLE基因的CLE基序(E值<10-7),确定6个蔷薇科物种的CLE基因,共鉴定出91个CLE基因(表2)。根据基因ID的顺序,将已鉴定的基因分别命名为:PbrCLE1—PbrCLE35、PmCLE1—PmCLE8、PpCLE1—PpCLE17、RoCLE1—RoCLE16、FvCLE1—FvCLE7和MdCLE1—MdCLE8(表2)。通过对梨CLE多肽家族的理化性质分析发现,该家族编码的多肽长度为 54～348个氨基酸,最大和最小蛋白质相对分子质量分别为5.72×103和38.31×103;PbrCLE5的等电点最小(4.60),PbrCLE11的等电点最大(12.51),PbrCLE等电点的平均值为9.85,表明该家族多肽偏碱性。

2.2 蔷薇科果树中系统进化和保守基序分析

使用MEGA X软件,对检索到的6个蔷薇科物种和拟南芥CLE多肽序列共同构建系统发育树(图1)。参考拟南芥[13]中CLE基因的分类,将其分为4组:Group-A、Group-B、Group-C和Group-D。Group-A含有蔷薇科果树CLE基因最多(34个),其次是Group-B(23个)和Group-C(22个),而Group-D成员最少(12个)(表2)。

表2 6个蔷薇科物种中CLE基因的基本信息Table 2 Basic information of CLE gene of six species of Rosaceae

图1 蔷薇科果树和拟南芥CLE多肽序列系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of CLE peptide sequence in fruit trees of Rosaceae and Arabidopsis 进化树中五角星、三角形和正方形分别对应拟南芥、梨和其他蔷薇科物种(苹果、梅、草莓、黑树莓和桃)的CLE成员。红色、绿色、蓝色和橙色分别代表4个亚组:Group-A、Group-B、Group-C和Group-D。The pentagram,triangle and square of the evolutionary tree correspond to CLE members of Arabidopsis,Pyrus bretschneideri,and other Rosaceae species(Malus domestica,Prunus mume,Fragaria vesca,Rubus occidentalis and Prunus persica),respectively. Red,green,blue,and orange represent four different subgroups:Group-A,Group-B,Group-C and Group-D,respectively.

2.3 蔷薇科果树中CLE基因的染色体位置和共线性分析

由图2和表2可见:梨的35个CLE基因分布于12条不同的染色体上,因染色体组装不完善,另有3个基因(PbrCLE3、PbrCLE8和PbrCLE9)未能定位到染色体上;草莓的7个CLE基因位于5条不同的染色体上;苹果的8个CLE基因位于6条不同的染色体上;梅的8个CLE基因位于5条不同的染色体上,还有1个基因(PmCLE8)未能定位到染色体上;桃的17个基因位于6条不同的染色体上;黑树莓的16个CLE基因位于6条不同的染色体上。另外,对6个蔷薇科果树进行基因组内共线性分析,共发现19对共线基因,其中梨9对,苹果6对,桃4对,而草莓、梅和黑树莓中未发现共线基因对(图2)。

图2 CLE基因在蔷薇科果树中的染色体定位和共线性分析Fig.2 Chromosomal localization and collinearity analysis of the CLE genes in Rosaceae fruit trees 具有共线关系的基因对由红线连接,灰色背景代表所有共线性对。Gene pairs with a collinear relationship were connected by a red line,and the gray background represents all the collinearity pairs.

2.4 梨基因结构和保守结构域分析

由图3可见:从35个PbrCLE的基因结构中,可以发现大部分PbrCLE基因缺少内含子。仅6个PbrCLE基因具有内含子,其中4个PbrCLE基因有1个内含子,2个PbrCLE基因有2个内含子。通过MEME在线软件分析梨的35个CLE多肽的序列特征,发现有5个保守基序,35个成员的motif 1中均含有CLE结构域的基序,3个成员含有motif 2,8个成员含有motif 3,2个成员含有motif 4,3个成员含有motif 5。通过比较35个PbrCLE基因的CLE结构域,发现其高度保守。同时,许多位于不同染色体上的PbrCLE基因含有相同或几乎相同的CLE基序,例如:PbrCLE1、PbrCLE2和PbrCLE22含有相同的CLE结构域;PbrCLE8、PbrCLE9和PbrCLE35含有相同的CLE结构域;PbrCLE4、PbrCLE13和PbrCLE31含有相同的CLE结构域。另外还有含有相同CLE结构域的基因对,如PbrCLE16/PbrCLE21、PbrCLE27/PbrCLE34,表明这些基因可能存在相似的功能。

2.5 CLE多肽家族重复事件分析和Ka/Ks分析

由表3可见:在PGDD数据库中共获得梨的同源基因对22对,其中10对为片段复制,2对为间隔复制,2对为串联复制,2对为转座复制,6对为随机复制。

由表3可见:通过Ks来估计梨CLE基因的进化时期或复制事件的时期,梨CLE基因对的Ks值为0.011 9～2.046 3,表明复制时间最早发生在68.211 5百万年前,最晚发生在0.395 7百万年前。通过计算梨22个基因对的Ka/Ks值,来估计驱动PbrCLE多肽家族进化的选择压力的种类。只有1对基因(PbrCLE4-PbrCLE13)的Ka/Ks值大于1,为阳性选择,而其余基因对的Ka/Ks值均小于1,表明这些基因主要通过纯化选择进化而来。

表3 梨CLE多肽家族同源基因对的Ka/Ks值Table 3 The Ka/Ks values of homologous gene pairs for CLE peptide family in pear

2.6 梨CLE基因在不同组织的表达模式

使用转录组数据分析梨CLE基因在不同组织中的表达模式,发现有2个基因未在所取材料中表达(PbrCLE2和PbrCLE6),其他33个基因至少在1个组织中表达[26]。由图4可见:在茎中PbrCLE4、PbrCLE31和PbrCLE34表达量较高;PbrCLE11在叶和芽中表达量最高,其次是PbrCLE31;子房中表达量最高的是PbrCLE26;果实中大部分基因都未表达,表达量最高的是PbrCLE31;花瓣中表达量最高的为PbrCLE29,其次为PbrCLE11和PbrCLE24;萼片中表达量最高的是PbrCLE24,其次为PbrCLE26和PbrCLE31。

图6 PbrCLE12、PbrCLE24 和PbrCLE31在梨花柱不同发育阶段的相对表达量Fig.6 The relative expression level of PbrCLE12,PbrCLE24 and PbrCLE31 at different developmental stages of pear style

分析梨CLE基因在不同花柱的转录组数据,结果显示有13个基因在所取花柱材料中表达[27]。由图5 可见:PbrCLE24和PbrCLE31在未授粉花柱、异交授粉花柱和自交授粉花柱中表达量均较高。进一步以梨不同发育阶段的花柱为材料,包括开花前5、3和1 d,开花当天(开花0 d),开花后1和5 d,将3个CLE基因进行RT-qPCR分析,结果(图6)显示:PbrCLE12和PbrCLE31表达量在花柱发育阶段的变化趋势基本一致,呈先下降再上升再下降的趋势;PbrCLE24表达量在花柱发育阶段中先上升再下降。

图5 PbrCLE基因在梨花柱中表达热图Fig.5 Expression heatmap of PbrCLE gene in pear style UP:未授粉花柱Unpollinated style;SP:自交授粉花柱Self-pollinated style;CP:异交授粉花柱Cross-pollination style.

图4 PbrCLE基因在梨各组织中的表达热图Fig.4 Expression heatmap of PbrCLE gene among different tissues in pear Stem:茎;Leaf:叶;Ovary:子房;Ftuit:果实;Bud:芽;Petal:花瓣;Sepal:萼片。红色表示高表达,蓝色表示低表达。下同。Red indicates high expression and blue indicates low expression. The same as follows.

分析梨CLE基因在花粉发育过程中的转录组数据[28],观察到4个基因在花粉中有表达(图7)。将4个CLE基因进行RT-qPCR验证,结果(图8)表明:花粉萌发率和花粉管长度为RT-qPCR提供参照,PbrCLE3的表达量在花粉生长前期一直保持较低的水平,在停止生长的花粉(SPT)中表达量有明显上升的趋势;PbrCLE7在水合的花粉(HP)和SPT中表达量较高;PbrCLE12在HP中表达量较高;PbrCLE28在正常生长(PT)和SPT中表达量较高。

图7 PbrCLE基因在梨花粉不同发育阶段的表达热图Fig.7 Expression heatmap of PbrCLE gene at different developmental stages of pear pollenMP:花粉粒;HP:水合花粉粒;PT:生长的花粉管;SPT:停止生长的花粉管。下同。MP:Pollen grain;HP:Hydrated pollen grains;PT:Growing pollen tube;SPT:Stop growing pollen tube. The same as follows.

图8 梨花粉不同发育阶段的花粉萌发率、花粉管长度以及基因相对表达量Fig.8 Germination rate,pollen tube length and relative expression level of gene at different developmental stages of pear pollen a.梨花粉不同发育阶段的花粉萌发率;b.梨花粉不同发育阶段的花粉管长度;c—f分别表示PbrCLE3、PbrCLE7、PbrCLE12和PbrCLE28在梨花粉不同发育阶段的相对表达量。a. Germination rate at different developmental stages of pear pollen ;b. Pollen tube length at different developmental stages of pear pollen;c-f indicate the relative expression levels of PbrCLE3,PbrCLE7,PbrCLE12 and PbrCLE28 at different developmental stages of pear pollen,respectively.

2.7 外源CLE多肽对梨花粉管生长的影响

由图9可见:合成多肽PbrCLE3、PbrCLE7、PbrCLE12和PbrCLE24对花粉管长度无显著作用,而PbrCLE31显著抑制梨花粉管生长。进一步通过不同浓度的PbrCLE31多肽处理梨花粉,发现100 μmol·L-1PbrCLE31的抑制效果更明显。

图9 外源CLE多肽对梨花粉管生长的影响Fig.9 Effect of exogenous CLE peptides on the growth of pear pollen a. 外源多肽PbrCLE31(100 μmol·L-1)处理后梨花粉管的生长情况,bar=60 μm;b. 不同多肽处理对花粉管生长的影响;c. 不同浓度PbrCLE31处理对花粉管长度的影响。a. The growth of pear pollen tube after treatment with exogenous peptide PbrCLE31(100 μmol·L-1),bar=60 μm;b. The effect of different peptide treatments on pollen tube growth;c. Effect of different concentration of PbrCLE31 on the length of pollen tube. *P<0.05,**P<0.01.

3 讨论

多肽激素CLE在植物生长发育中具有重要调控作用,已在多个物种中鉴定到CLE基因。本研究从6个蔷薇科物种中共筛选鉴定到91个CLE基因。根据蔷薇科果树和拟南芥的CLE多肽序列进行系统发育分析,将其分为4组(Group-A—Group-D)。Group-A是最大的组,其中,AtCLE10、AtCLE9、PbrCLE30、PmCLE1、PpCLE4和RoCLE9具有相同的基序。在拟南芥中,CLE9/10可通过不同的受体影响气孔和维管束发育[29]。AtCLE17对拟南芥的茎尖分生组织(shoot apical meristem)活性有影响[30],并且可以影响根的发育[31]。AtCLE17、PbrCLE35、PbrCLE8、PbrCLE9和PmCLE2具有高度相似的基序,推测基序相同或者相似的基因可能具体相同的功能。在Group-B中,AtCLE1、AtCLE4和AtCLE7在根中显示特定的表达模式,并参与调节拟南芥中根的结构[32]。AtCLE3、AtCLE4、PbrCLE1、PbrCLE2、PbrCLE22和RoCLE2具有相同的基序,因此推测PbrCLE1、PbrCLE2、PbrCLE22和RoCLE2也可能参与根的发育。该组还包括研究最多的AtCLV3,AtCLV3被各种平行受体复合物所感知,从而限制了干细胞促进转录因子WUS(WUSCHEL)的表达,同时AtCLV3可以和WUS形成负反馈信号环路,目的是维持顶端分生组织中干细胞群的活性[33];而AtCLV3、PbrCLE16、PbrCLE21、PpCLE16和RoCLE12也具有几乎相同的基序。在Group-C中,AtCLE25、AtCLE26和AtCLE45含有相似的CLE结构域。在拟南芥中,CLE25和CLE45在调节根系结构中起重要作用[34-35],表明该组的蔷薇科成员可能同样对根系发育也起着重要的调节作用。在Group-D中,与典型的Lys残基相反,该组位置1是Ala残基。与其他3个组相比,该组CLE基序的保守性最高。AtCLE41、AtCLE44、FvCLE1、PbrCLE13、PbrCLE31、PbrCLE4、PmCLE4、PmCLE7、PpCLE17和RoCLE1具有相同的CLE基序,AtCLE42、FvCLE2和RoCLE4具有相似的基序,这些成员都可以作为导管分子分化抑制因子(tracheary element differentiation inhibitory factor,TDIF)。TDIF抑制导管的分化,并促进细胞增殖[36],表明这些蔷薇科物种中CLE基因也可能具有相似功能。同时TDIF参与控制拟南芥中分生组织的增殖和分化[37]。因此,推测该组的蔷薇科成员可能都具有可调节花序、叶片或枝条发育的功能。

基因复制的不同类型共同促进了梨CLE多肽家族的进化,主要包括全基因组复制(WGD)或片段复制(SD)、串联复制(TD)、间隔复制(PD)、转座复制(TRD)和随机复制(DSD)[22,38]。不同的基因复制事件对基因家族的扩展有不同的贡献[39],梨基因组的所有成员主要发生2次全基因组重复事件,一个是三倍体加倍(γ)(Ks≈1.5～1.8),另一个是最近的全基因组复制(Ks≈0.15～0.30)[40-41]。本研究中梨CLE同源基因对的Ks值为0.011 9～2.046 3,而且除了同源基因对PbrCLE12-PbrCLE33(Ks=1.510 7)外,其他同源基因的Ks值都不在1.5～1.8内,说明大部分PbrCLE没有经过三倍体加倍过程。梨CLE同源基因对中,除了1对基因PbrCLE4-PbrCLE13外,Ka/Ks值均小于1,表明纯化选择是梨CLE多肽家族多样化的主要进化力量。

用化学合成的CLE多肽进行体外处理是一种模拟内源性CLE多肽功能的方法[10]。本研究根据表达模式选择5个CLE多肽进行合成,分别为花柱中表达的基因PbrCLE24和PbrCLE31,花粉中表达的基因PbrCLE3和PbrCLE7,在花粉和花柱中均有表达的基因PbrCLE12。通过体外处理梨花粉,发现PbrCLE31对梨花粉管生长有一定的抑制作用,这为进一步探明CLE多肽调控花粉管生长的分子机制提供了试验基础。

综上,本研究通过生物信息学分析在蔷薇科果树中鉴定出91个CLE基因,为深入研究蔷薇科果树中多肽的功能奠定基础。通过拟南芥中CLE基因的功能,推测了其同源物在梨中发挥的作用,其中PbrCLE31对梨花粉管生长有抑制作用,但PbrCLE31调控梨花粉管生长的信号路径还需进一步研究。