辣椒疫霉菌PcPLD8基因的克隆和表达分析

杨 磊，朱彤彤，刘应保，夏 帆，孙文秀

(长江大学生命科学学院，中国 荆州 434025)

由辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)引起的辣椒疫病是一种重要的土传病害，防治困难，对全球多种蔬菜作物生产造成重大的经济损失。我国是农业大国，辣椒作为重要的经济作物，种植面积日益扩大，辣椒疫病的发生也愈加严重[1]。疫霉菌属于卵菌，其菌丝无隔膜，细胞壁主要成分是纤维素，且在整个生命周期中都是以二倍体存在[2]，与真菌存在明显的差别，导致市场上多种防治真菌的化学药剂无法对疫霉菌产生作用，也就达不到防治卵菌病害的目的。

磷脂酶D(phospholipase D, PLD)是一种普遍存在于真核生物中的磷脂水解酶，通常有两个高度保守的催化基序，这些基序由HxKxxxxD组成(简称HKD1和HKD2)，它们对于磷脂酶D的催化活性是必需的[3，4]。磷脂酶D参与调节植物和真菌的多种生理过程，涉及植物的生长发育、抗逆反应及免疫调节和真菌的有性生殖及致病力[5-9]。研究发现，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中Spo14/PLD的缺失能够抑制孢子减数分裂过程中子细胞膜的形成，进而导致产孢量的下降[10]。禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)FgPLD1敲除突变体菌丝生长受到明显抑制，产孢量减少，致病力明显减弱[11]。致病疫霉菌(P.infestans)磷脂酶D分为6个亚家族，其中sPLD-likes和PLD-likes类磷脂酶D是致病疫霉菌的致病因子[12]。

目前，真菌磷脂酶D的研究报道较少，对于卵菌的相关研究则更少。本研究从辣椒疫霉菌LT1534中分离鉴定到1个磷脂酶D基因，命名为PcPLD8。对其进行生物信息学分析，再通过实时荧光定量PCR技术检测其在辣椒疫霉菌不同发育时期和侵染时期的表达情况，并在本氏烟上进行瞬时表达接种测定其致病性，这些结果将为进一步研究磷脂酶D在辣椒疫霉菌致病过程中的作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验菌株辣椒疫霉菌LT1534保存于本实验室。pEASY-T3载体、常用感受态细胞EscherichiacoliDH5α、农杆菌感受态GV3101及Blue Plus®Protein Marker购自北京全式金生物技术有限公司。DL2000 Plus DNA Marker，2×Phanta Max Master Mix (Dye Plus)，ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix (Low ROX Premixed)及HiScript®II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)购自诺唯赞生物公司。Total RNA Kit I和E.Z.N.A.® Gel Extraction Kit购自OMEGA公司。EndoFree Plasmid Mini Kit购自CWBI公司。植物表达载体pBIN-GFP2由南京农业大学植物保护学院窦道龙教授惠赠。

试验植株本氏烟(Nicotianabenthamiana)和辣椒(实验室自交系品种06221)，温室16 h光照/8 h黑暗种植，在24 ℃左右恒温培养。

1.2 基因克隆与载体构建

在辣椒疫霉菌LT1534基因组数据库中，以酿酒酵母SPO14/PLD氨基酸序列通过BLAST搜索得到PcPLD8(JGI登录号: 568375)基因。以辣椒疫霉菌cDNA为模板，采用特异性引物PcPLD8F(5′-TCCCCCGGGATGGACGGACTTAGTCGCG-3′)/PcPLD8R(5′-CGCGGATCCGTTGTCACCCTCGACGTCC-3′)进行PCR扩增。PCR反应体系为：25 μL 2×Phanta Max Master Mix，4 μL DNA，17 μL ddH2O，2 μL Forward Primer (10 μmol·L-1)，2 μL Reverse Primer (10 μmol·L-1)，共50 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，32个循环；72 ℃补充延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，回收特异条带，连接到克隆载体pEASY-T3，菌落PCR验证，阳性克隆送青岛擎科生物技术公司测序。

1.3 生物信息学分析

通过在线软件ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)预测蛋白质基本理化性质；利用SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽预测；通过TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测跨膜结构；利用InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/)和NCBI-CDD (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi)进行保守结构域分析；通过CELLO软件(http://cello.life.nctu.edu.tw/)预测亚细胞定位；利用ClustalW软件对PcPLD8与6类致病疫霉PLD进行氨基酸序列比对分析；利用MEGA6.0软件邻接法(Neighbor-Joining, NJ)构建系统发育树。

1.4 样品制备与总RNA提取

分别收集辣椒疫霉菌LT1534的营养菌丝(MY)、孢子囊(SP)、游动孢子(ZO)、休止孢(CY)和萌发的休止孢(GC)，取LT1534游动孢子悬浮液(2×104个/mL)20 μL滴加于辣椒叶片上，25 ℃保湿静置培养，在接种后0，1.5，3，6，12，24，48，72 h分别收取样品，具体方法参考文献[13]。采用Total RNA Kit I试剂盒提取辣椒疫霉菌LT1534不同发育时期样品和侵染后辣椒叶片的总RNA。

1.5 实时荧光定量PCR分析

利用HiScript®II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)反转录试剂盒合成cDNA 第一链，具体步骤参考文献[14]。设计荧光定量PCR引物(见表1)，以cDNA为模板，按照实时荧光定量试剂盒ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix (Low ROX Premixed)说明书进行操作，以β-actin作为内参基因。反应体系为：10 μL 2×SYBR Green Mix，上下游引物各0.4 μL，cDNA 4 μL，加水补足至20 μL，反应程序为95 ℃ 5 min；95℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，40 个循环。具体操作参考文献[15，16]。重复3次，PcPLD8基因的相对表达量采用 2-ΔΔCT法计算。

表1 荧光定量PCR引物序列

1.6 农杆菌介导的基因瞬时表达

利用限制性内切酶SmaⅠ和BamH I将PcPLD8基因和载体pBIN-GFP2双酶切，连接并转化至大肠杆菌DH5α，阳性克隆送青岛擎科生物技术公司测序。采用冻融法将重组植物表达载体pBINGFP2:PcPLD8转入农杆菌GV3101，接种于液体LB培养基，28 ℃培养20 h，离心收集菌体，用缓冲液(10 mmol·L-1MES, 10 mmol·L-1MgCl2, 200 mmol·L-1AS)重悬菌体，调节OD600值为0.5，在4～6周龄的本氏烟叶片上进行接种，以pBIN-GFP2作为空白对照，重复3次，每次至少15片叶片[17]。

2 结果与分析

2.1 辣椒疫霉菌PcPLD8基因的克隆

图1 辣椒疫霉菌PcPLD8基因的克隆Fig. 1 Cloning of PcPLD8 gene from P. capsici

以辣椒疫霉菌LT1534 cDNA为模板，用特异性引物PcPLD8-F/PcPLD8-R进行PCR扩增。电泳结果表明，在1 500 bp左右有一条特异性条带，与预期大小相符(见图1)。测序结果表明，PcPLD8基因CDS为1 596 bp，编码531个氨基酸(见图2)。

2.2 PcPLD8基因的生物信息学分析

对PcPLD8基因进行生物信息学分析，发现该基因编码的蛋白质，相对分子质量为60 689，理论pI值为4.85。SignalP 5.0信号肽预测显示，该基因不含信号肽。在线软件TMHMM分析发现，PcPLD8无跨膜区。NCBI和InterPro在线分析结果显示，该蛋白具有两个典型的HKD结构域(见图2方框)，属于PLD超家族蛋白。CELLO亚细胞定位预测显示，PcPLD8可能位于细胞质。

通过MEGA6.0将PcPLD8与已报道的酿酒酵母SPO14/PLD(NP_012956.3)、禾谷镰刀菌FgPLD1(FGSG_09917)、FgPLD2(FGSG_01973)、FgPLD3(FGSG_06175)、拟南芥PLD(NP_188194.1)、亚洲棉PLD(KHG24518.1)、致病疫霉中的PXPH-PLD (PITG_03651)、PXTM-PLD (PITG_00284)、TM-PLD (PITG_16798)、sPLD-like-A (PITG_18185)、sPLD-like-B (PITG_12806)、PLD-like (PITG_00291)进行系统发育树分析，发现PcPLD8与PITG_00291进化关系最近，蛋白序列相似性为94.54%(见图3)，这说明PcPLD8属于PLD-like磷脂酶D亚家族蛋白。

图3 不同物种PLD系统发育树Fig. 3 Phylogenetic tree of PLD in different species

2.3 PcPLD8基因在辣椒疫霉菌不同生长发育时期的表达分析

通过实时荧光定量PCR方法检测PcPLD8基因在辣椒疫霉菌生长发育时期的表达情况。由图4可以看出，PcPLD8在辣椒疫霉菌不同发育时期的相对表达量呈现上升—下降—上升的总体趋势，在GC(孢子萌发)时期急剧升高达到最大值。

图4 PcPLD8在辣椒疫霉菌发育时期的相对表达量Fig. 4 Expression level of PcPLD8 during the developmental stages of P. capsici

2.4 PcPLD8基因在辣椒疫霉菌侵染辣椒后不同时期的表达分析

通过实时荧光定量PCR方法检测PcPLD8基因在辣椒疫霉菌侵染辣椒后不同时期的表达情况。由图5可以看出，辣椒疫霉菌侵染辣椒后，PcPLD8基因表达量呈现上调趋势，在侵染后48 h和72 h时显著升高。

图5 PcPLD8在辣椒疫霉菌不同侵染时期的相对表达量Fig. 5 Expression level of PcPLD8 during the infection stages of P. capsici

2.5 辣椒疫霉菌侵染过程中PcPLD8的功能分析

将重组植物表达载体pBINGFP2:PcPLD8转入农杆菌GV3101，利用农杆菌介导的瞬时表达技术，在本氏烟上进行接种，24 h后接种辣椒疫霉游动孢子，48 h后紫外灯下观察。结果表明，PcPLD8和GFP空载体均能在本氏烟中表达(图6B)。相对于GFP空载体对照，PcPLD8显著增强辣椒疫霉菌的侵染(图6A)，其病斑大小明显高于对照(图6C)。

图6 辣椒疫霉菌侵染过程中PcPLD8的功能分析Fig. 6 Function analysis of PcPLD8 during the infection stages of P. capsici

3 讨论

磷脂酶D催化磷脂在其末端磷酸酯键处水解，从而产生磷脂(PA)，两者一起参与细胞的多种生理过程，主要包括病细胞增殖、膜囊泡运输、信号传导和细胞骨架重排。PLD是一个高度保守的多基因家族，两个HKD保守基序是PLD的活性位点[9]。目前病原卵菌疫霉属中已发现6个亚科的PLD种类，分为PXPH-PLD，PXTM-PLD，TM-PLD，PLD-like以及A和B型sPLD-like[18]，不同类型的磷脂酶D在疫霉菌中可能发挥着不同的功能。本研究中通过同源比对在辣椒疫霉菌LT1534基因组中筛选到一个磷脂酶D基因PcPLD8，并成功克隆得到其全长cDNA序列。生物信息学分析发现，PcPLD8不含信号肽，无跨膜结构，包含两个HKD保守结构域，HKD1为突变的HKR，预测定位于细胞质，蛋白序列与致病疫霉PLD-like-1(PITG_00291)相似性为94.54%，系统发育树分析表明PcPLD8是典型的PLD-like类磷脂酶D。

文献研究表明，致病疫霉菌游动孢子分化为包囊的过程是由PA和G蛋白共同触发，包囊化是病原菌侵染宿主的关键步骤，并发现PLD与游动孢子包囊化有关[19]。酿酒酵母Spo14/PLD对其孢子的萌发至关重要[10]。本研究通过实时荧光定量PCR技术检测PcPLD8在辣椒疫霉菌发育时期的相对表达量，发现其在孢子萌发时期的表达量达到最大值，表明该基因可能在孢子萌发过程中发挥着重要作用。在病原菌与植物的互作过程中，病原菌PLD被认为是重要的致病因子，参与病原菌侵染力的调控。诸如sPLD-like和PLD-like类磷脂酶D可能通过破坏宿主的细胞膜，从而提高致病疫霉菌的定殖能力[12]。本研究发现PcPLD8在辣椒疫霉侵染辣椒后，其表达量呈现上调趋势，在侵染72 h时显著升高。农杆菌介导的基因瞬时表达结果表明，PcPLD8显著增强了辣椒疫霉菌对本氏烟的致病力。上述结果表明，PcPLD8在辣椒疫霉菌致病过程中发挥着重要的作用。

综上所述，PcPLD8可能参与调节辣椒疫霉菌的孢子萌发，且PcPLD8的激活与辣椒疫霉菌的致病力密切相关。这些结果有助于阐明PLD在辣椒疫霉菌生长发育过程和致病过程中的作用机制，同时也为植物免疫寻找新的靶标基因。