运动通过microRNA-218-5p/HMGB1/TLR4途径改善OJ致肠黏膜屏障损伤的研究

吴 振，陈 伟，邵长凤，陈 勇

(1.湖南机电职业技术学院人文科学学院, 中国 长沙 410151;2.湖南体育职业学院，中国 长沙 410019;3.湖南师范大学体适能与运动康复湖南省重点实验室,中国 长沙 410081;4.长沙职业技术学院，中国 长沙 410217)

阻塞性黄疸(obstructive jaundice,OJ)指左右肝管及其以下的胆管完全或不完全阻塞，在消化期间，由阻塞致胆汁积聚，胆红素进入血液，导致皮肤黄染严重[1,2]。肠道胆汁缺乏会导致肠粘膜的多屏障损伤[3]，细菌和内毒素等经肠黏膜到达血液循环，引发多器官功能障碍[4]。高迁移率族蛋白1(HMGB1)作为Toll样受体2/4(TLR-2/4)配体，可通过多条途径激活核转录因子-κB(nuclear actor-κB，NF-κB)，释放大量炎症因子参与多种肠损伤[5]。研究发现，OJ致HMGB1水平升高可能导致全身性炎症和多器官功能障碍[6,7]。microRNA (miRNA)是一类内源性非编码小RNA分子，在细胞的凋亡、增殖、自噬、分化等多种生物学过程中均发挥着有效的调控作用。研究表明[8]：miR-218对HMGB1的表达具有一定调节作用[9]。介导HMGB1细胞自噬，调控子宫内膜癌的发展[10]。Zhang等[11]阐明了miR-218-5p与HMGB1之间的靶向关系，其通过下调HMGB1调节前列腺癌。因此，可预测在肠黏膜损伤的发生进展过程中，miR-218-5p通过调节HMGB1-TLR4通路发挥其潜在作用。随着胆道梗阻时间增加，肝脏和肠道等受损伤程度会加重。手术解梗后，身体恢复所需时间较长。多项研究表明运动对miRNA具有调控作用，可减弱HMGB1、TLR4等多种炎症因子致使的损伤[12]。如耿元文[13]等发现有氧运动提高心梗大鼠肾脏miR-21表达, 抑制TLR4/NF-κB信号通路，减缓肾脏炎症反应。但运动对miR-218-5p的作用和改善OJ致肠损伤效应如何目前尚无关注。

1 实验方法

1.1 主要仪器和试剂

主要仪器：YD-6D型生物组织石蜡包埋机，YD-A生物组织摊烤片机，倒置相差显微镜，LEICA RM2235 切片机，WFG 7200型可见分光光度计，Bio-Rad CFX96Touch 实时荧光定量 PCR仪，高速低温离心机，099C K54型电动匀浆机，高性能超净工作台。主要试剂：Trizol(Inventragtion)，反转录试剂盒(TAKA-RA，美国)，PCR mRNA引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)，miR-218-5p引物(Ribobio)，兔抗多克隆抗体(HMGB1，TLR4，NF-κBp65)及TBIL，ALT，AST，DAO检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，DAB显色试剂盒(武汉博士德)，D-乳酸试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)。

1.2 构建动物模型与分组

购于湖南斯莱克景达实验动物中心的成年雄性昆明种(KM)小鼠(许可证 SCXK(Xiang) 2016-0002)，饲养于温度24 ℃左右及湿度50 ℃左右的环境中，小鼠每笼5只左右，水和啮齿类动物饲料充足，在动物房适应饲养一段时间后构建黄疸模型。对以往常用的大鼠构建模型方法进行改进[14], 用更加安全方便的方法构建黄疸小鼠模型。详细建模步骤如下：将小鼠麻醉后，腹部消毒，修剪腹部毛发，轻轻纵向剪开腹部表皮，控制伤口长度约1.5 cm，将胆总管分离出来，用不可吸收手术线将其悬挂在腹壁，并避免损伤其他组织，缝合切口。假手术组(S)的小鼠只做同上长度的切口并缝合。2天后剪断腹壁外的手术线，将胆总管回位。将构建OJ模型成功的小鼠随机均分为模型组(M)和运动组(TM)，假手术组小鼠为空白对照，每组均10只。

1.3 干预方案

胆总管回位5 d后，在黄疸小鼠的术后恢复期间，TM组进行运动训练，采用中等强度跑台运动，坡度设置为0，速度设置为10 m·min-1，每天在固定时间训练，每天30 min，每周6 d，共训练6周。M组和S组不进行干预。

1.4 样品采集与处理

运动训练6周后，前一晚小鼠禁食，次日腹腔注射1%的戊巴比妥钠麻醉，剂量为50 mg·kg-1，用摘眼球的方式取血到抗凝管中，离心15 min，吸取上层血清样品，用离心管分装并做好标签，于-20 ℃的冰箱中保存。剪开小鼠腹腔，提起肠管，在靠近回盲部的末端回肠切取3段，每段长约1～2 cm，放入生理盐水中，小心清洗，将回肠的内容物清除干净，末端组织置入已加入1 mL trizol的冻存管，于-80 ℃冰箱储存；中端组织先使用液氮进行速冻，然后储存于超低温冰箱，以便后续检测基因和蛋白表达；近端组织固定于10%多聚甲醛中，备石蜡包埋切片，用于免疫组织化学染色以及HE染色。

1.5 病理学观察

取固定好的回肠组织，用乙醇进行脱水，由低浓度向高浓度依次进行；为使石蜡能够更好地渗入回肠组织，用二甲苯进行透明，石蜡进行包埋处理。用切片机将组织切成厚度约3.0 mm的切片，用捞片法进行贴片。HE染色后，使用二甲苯透明，封片后在光学显微镜下观察组织的形态变化。

1.6 血清学指标检测

血清中总胆红素(TBIL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的含量使用全自动生化分析仪测定；血清中二胺氧化酶(DAO)活性使用速率法检测；血清D-乳酸水平使用ELISA法检测。

1.7 RNA逆转录和实时荧光定量 PCR

PCR检测过程严格参照cDNA逆转录试剂盒的说明书，合成 cDNA。每个样本在操作时均设置3个重复。首先使用 Prime Script© RT Master Mix Perfect Real Time kit 定量检测 HMGB1、TLR4和NF-κBp65 mRNA 的表达水平，One Step Prime Script© miRNA cDNA Synthesis Kit 试剂盒逆转录试剂盒和 SYBR Green PCR Master Mix Kit PCR试剂盒逆转录与定量miR-218-5p的水平。使用 CFX Connect PCR 系统进行实时荧光定量 PCR，循环40 个 PCR，GAPDH 和 U6 分别作为mRNA和miRNA的内部参照。由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成HMGB1、TLR4和 NF-κBp65 mRNA基因引物，引物详细合成序列见表1，miR-218-5p和U6的引物由广州 Ribobio生物科技有限公司提供。组织中基因表达水平采用 2-ΔΔCT法计算。

表1 mRNA基因引物序列

1.8 免疫组织化学染色

回肠组织HMGB1，TLR4，NF-κBp65蛋白的表达采用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术(SABC法)检测，严格参照说明书的步骤进行操作。切片脱蜡，复水，用蒸馏水反复漂洗后，进行微波抗原修复。用PBS反复清洗后，将切片放于湿盒中，用免疫组化笔标记，等待干燥后再润湿，加入5%的山羊血清封闭液，温育10 min，温度控制在20 ℃左右。滴加一抗(1∶100)于室温下孵育1 h。PBS多次清洗后，滴加二抗(即用型SA1050-小鼠/兔IgG) ，于室温下孵育30 min。PBS多次清洗后，滴加DAB显色液，DAB显色液现配现用，放于室温下显色2～6 min，掌握显色颜色程度。流水反复冲洗后，终止显色反应。置于苏木素中复染50 s左右，用流水反复冲洗。用1%盐酸酒精分化，饱和碳酸锂溶液进行返蓝，反复清洗，脱水，透明，滴加中性树胶，封片。用PBS替代一抗，作为阴性对照。用Simple PCI图像分析系统(C-imaging公司)对免疫组化阳性表达面积进行结果分析，Olympus(Jarm)光学显微镜下，观察HMGB1，TLR4，NF-κBp65阳性表达面积，计算阳性表达面积的百分比(阳性反应面积/测量总面积的数值)。

1.9 统计学分析

所有数据的计算统计均在SPSS 19.0软件中进行。计量结果均采用x±s表示，采用t检验的方法比较两组间的差异，P<0.05被认为差异具有显著意义，P<0.01为差异非常显著。

2 结果

2.1 一般情况

建模小鼠在手术过程或手术结束后，未出现死亡情况。梗阻一天后，小鼠出现精神不佳、行动缓慢、毛发较杂乱色泽差、尿色轻微变黄的症状。随梗阻时间增加，小鼠尾巴等部位也出现了发黄的症状，大便色泽轻微变浅。解除梗阻后的恢复期间，小鼠精神状况较好，能进行中低强度的有氧运动。运动干预6周后，以上一般行为学表现均得到一定改善。

2.2 回肠组织病理学改变

S组小鼠肠黏膜正常，为正常小鼠肠粘膜组织形态，肌层完整。M组肠黏膜结构严重破坏，绒毛稀疏，间质出现明显水肿症状，炎症细胞浸润明显。TM有氧运动组肠黏膜屏障损伤情况有一定改善，细胞形态正常，无水肿现象，少有炎症细胞浸润(图1)。

图1 各组小鼠回肠组织病理切片HE染色图Fig. 1 HE staining of pathological sections of ileum tissue of each group of mice

2.3 肝功能测定结果

图2显示，M组小鼠血清中TBIL，ALT和AST的含量最高，规律有氧运动过后，TM组血清TBIL，ALT和AST的含量与M组相比明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

注：与S组比较，*P<0.05，**P<0.01；与M组比较，#P<0.05，##P<0.01。下同。图2 各组血清TBIL，ALT和AST含量的比较(n=10)Fig. 2 Comparison of serum TBIL, ALT and AST contents in each group (n=10)

2.4 血清DAO和D-乳酸测定结果

S组血清中DAO和D-乳酸含量最低，M组含量最高，TM组较M组含量下降(P<0.01)，见图3。

图3 各组血清DAO和D-乳酸含量的比较(n=10)Fig. 3 Comparison of serum DAO and D-lactic acid contents in each group (n=10)

2.5 各组小鼠回肠miR-218-5p检测结果

图4显示，S组与M组小鼠miR-218-5p表达无显著性差异，但有氧运动过后其表达较M组升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图4 各组小鼠回肠组织miR-218-5p表达量(n=10)Fig. 4 miR-218-5p expression in ileum of each group of mice (n=10)

2.6 各组小鼠回肠HMGB1，TLR4及NF-κBp65 mRNA检测结果

M组小鼠HMGB1，TLR4及NF-κBp65 mRNA表达量最高，S组最低，TM组显著低于M组(P<0.01)，见图5。

图5 各组小鼠回肠组织HMGB1，TLR4及NF-κBp65 mRNA表达量(n=10)Fig. 5 HMGB1, TLR4, NF-κBp65 mRNA expression in ileum of each group of mice (n=10)

2.7 各组小鼠回肠HMGB1，TLR4和NF-κBp65免疫组织化学染色结果

免疫组化结果显示，在S组中，小鼠回肠组织HMGB1，TLR4和NF-κBp65三者的阳性表达是最低的，而在M组中的阳性表达是最高的，阳性表达面积从小到大依次是S组、TM组、M组(图4，图5) 。

3 讨论

OJ主要由于胆管部分或者完全被阻塞，胆汁无法正常排入肠腔，使肠道内胆盐缺少，无法抑制细菌繁殖和降解肠源性内毒素，导致肠黏膜受损。较多实验采用大鼠造模，成活率高，手术难度低，但与人类相比，大鼠没有胆囊，生理结构与人类的差别较大[15,16]。本文采用与人类生理结构更相似的小鼠作为实验对象，使结果准确度更高。本实验中，采用改进的短期悬挂的方式进行造模，在操作上较方便，并能及时将悬挂的胆管解除梗阻，与人类黄疸术后的效果相似。悬挂解除后一周，小鼠死亡率十分低，且模型鼠黄疸症状明显；小鼠精神状态性良好，进行中低强度有氧运动十分顺利。随机抽取7只解剖进行模型验证，发现肝脏斑点状发黄，胆管畸形，肠黏膜色泽不红润。据此判断造模成功，并用于本实验。

DAO是一种细胞内酶，分布于肠绒毛顶端细胞，在小肠活性最高。损伤的肠黏膜通透性增加，DAO释放进入血液循环，是反映肠黏膜屏障损伤的主要指标[17]。D-乳酸是肠道细菌发酵代谢产物，肠道损伤致肠绒毛顶端上皮脱落，通过受损肠黏膜入血，也可反映肠黏膜损伤程度及通透性变化[18]。本实验肠粘膜形态学结果显示，OJ组小鼠回肠呈现严重的病理损伤，进行运动训练的小鼠肠黏膜损伤明显减轻，说明6周的有氧运动对OJ后肠黏膜屏障发挥明显的保护作用。除HE染色外，各组小鼠血清DAO和D-乳酸水平从大到小均为：M组、TM组、S组，说明OJ后小鼠肠黏膜屏障受损，有氧运动对肠黏膜屏障具有明显的保护作用。

注：a～c分别代表HMGB1，TLR4及NF-κBp65因子；1～3分别代表S组、M组、TM组。图6 各组小鼠回肠组织HMGB1，TLR4及NF-κBp65免疫组织化学染色结果 (200×)Fig. 6 Immunohistochemical staining results of HMGB1, TLR4 and NF-κBp65 in ileum of each group of mice (200×)

图7 各组小鼠回肠组织HMGB1，TLR4及NF-κBp65免疫组织化学阳性表达率(n=10)Fig. 7 Immunohistochemical positive expression rate of HMGB1, TLR4 and NF-κBp65 in ileum of each group of mice (n=10)

大量研究报道，机体OJ致肠黏膜屏障功能损伤和肝网状内皮细胞功能障碍，会促进炎性细胞因子的释放，是导致全身性炎症发生的关键因素，也是OJ病人多脏器功能障碍的重要诱发原因[19]。HMGB1是一种重要的晚期炎症介质，除能大量从多种有核细胞自主分泌外，也可从损伤的细胞被迫分泌至外周血循环。多项研究证实HMGB1是TLR-2/4的重要内源性配体，两者结合后，通过MyD88 依赖途径和MyD88非依赖途径激活NF-κBp65，TLR4下游NF-κBp65激活后可以上调趋化因子及炎症因子的表达[20,21]。近期研究发现在OJ机体中，HMGB1水平的升高可能导致OJ中的全身性炎症[22]。本实验中，模型组的HMGB1，TLR4及NF-κBp65 mRNA相对表达水平显著高于假手术组，说明胆道阻塞之后，HMGB1，TLR4及NF-κBp65表达水平明显上调。

国内外许多研究发现，多种miRNA分子在肠黏膜组织中的异常表达均可致屏障功能受损。据报道miR-126通过抑制靶基因S1PR2激活PI3K/AKT信号通路，导致上皮细胞屏障功能受损[23]；miR-200b通过抑制TNF-α诱导的上皮细胞紧密连接蛋白破坏，从而保护肠黏膜屏障功能，miR-218表达下降与结直肠癌患者预后不良致使炎症爆发有关[24]。对于HMGB1与miRNA的研究也有部分报道，Yu[25]研究证实miR-218-5p的过表达降低了HMGB1的水平；Gu等[26]阐明了miR-218-5p与HMGB1之间为一种靶向关系，其通过下调HMGB1进一步调节前列腺癌。以上证明在肠黏膜屏障损伤发生及进展过程中，miR-218-5p通过调节HMGB1-TLR4通路发挥了重要作用。本研究结果显示，各组小鼠回肠组织中HMGB1及其下游因子 mRNA和蛋白表达水平从大到小为：M组、TM组、S组，miR-218-5p的表达与HMGB1呈相反趋势，这表明miR-218-5p可通过负性调控HMGB1改善OJ肠黏膜屏障损伤的过程。

有氧运动降低炎症的作用早已被证实，HMGB1和TLR4等多种炎症因子的降低与运动训练有关。多项研究表明，急性和慢性运动训练对miRNAs均具有一定调控作用[21]。12周耐力运动训练后，发现miRs-1，-133a，-133b和-206均显著下降，表明这些miRNAs可在运动后发生改变[28]。刘昕萌等[29]发现运动训练与血管生成、炎症、骨骼肌和心肌收缩相关，还对与肌肉适应低氧和缺血相关的大部分miRNAs有显著影响，如miR-210，-221，-222，-21，-146a，-133a和-146a等。有研究发现运动后miR-181b-5p显著增加，在肥胖及胰岛素抵抗等多种疾病中起重要作用[30]。本研究结果显示6周有氧运动后miR-218-5p表达显著上升，而HMGBI，TLR4及NF-κBp65 mRNA和蛋白表达显著下降。因此，推测有氧运动通过上调microRNA-218-5p，抑制HMGB1-TLR4通路及其下游信号因子的表达，减轻OJ小鼠肠粘膜的损伤，从而保护肠黏膜屏障功能。

4 结论

OJ后，胆汁排入肠腔受阻，致使肠黏膜屏障受损严重。6周的有氧运动训练，对肠黏膜屏障发挥了明显的保护作用。其机制可能与有氧运动上调了miR-218-5p，进而抑制HMGB1-TLR4通路及其下游信号因子的表达有关。