双酚A 对PK-15 猪肾细胞DNA 损伤和细胞凋亡的影响

张 卓，孔艳彪，高斌战，宋宝敏，赵 婷，袁建琴

（1.山西农业大学生命科学学院，山西太谷 030801；2.山西省兽用生物制品试验推广中心，山西太谷 030800）

双酚A（Bisphenol A，BPA）是一种环境内分泌干扰物[1-2]，在化学工业产品中使用十分广泛，主要用来生产聚碳酸酯和环氧树脂塑料，并广泛用于制造人们生活中经常接触到的物品，如食品罐、奶瓶和饮料容器等[2-5]。在恶劣的环境下，如高温、酸或碱等条件下，这些塑料制品中的BPA 会释放，并渗入到环境中[1，6]。目前，在人的羊水、血液、母乳、胎盘、汗液和尿液中都检测到BPA，在许多其他生物中也可检测到BPA[6-7]。环境污染可影响人的社会行为、焦虑水平、神经功能及神经递质含量等[1，6]。越来越多的研究表明，BPA 与动物健康异常有关，表现为中枢神经系统和肝脏内源性大麻素系统的改变、精子质量和数量指数性下降、神经内分泌紊乱、糖尿病、心脏病、肥胖症以及恶性肿瘤等疾病[1，8-12]，并发现BPA 可通过不同的作用机制发挥其毒性效应[8-10，13-15]。单细胞凝胶电泳又称彗星试验，是一种在单细胞水平上检测DNA 链损伤的方法，目前已成为全球研究热点[16-17]。

健康的肾脏对机体的内环境稳态和正常代谢是必不可少的。在病理状态下，多种因素在慢性肾病患者体内积聚，导致尿毒症和死亡率增加，以及包括虚弱、厌食、呕吐、睡眠障碍、神经病变、心血管疾病和进行性肾功能丧失在内的症状。因此，尿液毒素的清除伴随着临床症状的改善[18-20]。HUANG等[21]研究表明，氧化应激是BPA 毒性的一种基本机制。也有研究表明，BPA 可通过降低HepG2 细胞内超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性，提高活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平以及硫代巴比妥酸反应物（Thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）含量诱导细胞氧化应激[22]。ROS也会导致DNA 损伤[23]。在患不育症的男性中，接触BPA 有可能对精子DNA 的完整性和精子质量造成潜在损害[24]。受损的DNA 可影响细胞功能，导致癌症和各种慢性病疾病[25]。最近的研究表明，BPA 在细胞凋亡、增殖和迁移过程中具有毒性作用[6，26]。YUAN 等[26]证实了暴露于BPA 的Marc-145 细胞系中凋亡细胞和细胞核的数量明显高于Marc-145 细胞系对照组，表明BPA 可更加特异的影响Marc-145细胞凋亡，同时BPA 诱导的细胞凋亡可能与Marc-145 细胞炎症损伤有关。然而，目前有关BPA暴露对肾脏系统的毒性影响研究很少。

为了探究BPA 的肾毒性作用机制，本研究在前期研究的基础上选择10-3～10-6mol/L BPA[26]进行PK-15 猪肾细胞单细胞凝胶电泳试验和Hochest 细胞凋亡检测，分析BPA 对PK-15 猪肾细胞DNA 损伤和细胞凋亡的影响，为探讨BPA 对猪肾细胞损伤的可能作用途径，研究BPA 的肾毒性作用机制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 细胞系 PK-15 猪肾细胞系，由山西隆克尔生物制药有限公司提供。

1.1.2 主要试剂 BPA 为上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品（将2.282 9 g BPA 溶于10 mL 二甲基亚砜（DSMO，北京索莱宝公司提供），制成1 mol/L BPA 溶液，经0.22 μm 滤器过滤除菌后贮存于4 ℃冰箱备用。试验当天制备从1×10-6mol/L 到1×10-3mol/L 的BPA 稀释液）；胎牛血清、正常熔点琼脂糖、低熔点琼脂糖、肌氨酸钠、溴化乙锭、Triton-X-100、双抗和Hoechst 33342 染料（即用型）购自北京索莱宝科技有限公司。MEM液体培养基由北京通正生物技术有限公司提供。其他试剂均为分析纯，由山西农业大学生命科学学院细胞生物学实验室提供。

1.2 试验方法

PK-15 猪肾细胞在含有6%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 链霉素的MEM 中于5%二氧化碳培养箱中37 ℃孵育培养48 h。对照组为上述配方下含有0.1%DMSO 的PK-15 猪肾细胞MEM培养液。在相同条件下，所有试验都为6 个重复。

1.3 DNA 损伤检测

分别向每组PK-15 猪肾细胞培养瓶中接入2 mL 不同浓度梯度的BPA（分别含BPA 10-3、10-4、10-5、10-6mol/L）的MEM 液体（含3%胎牛血清和100 U/mL 的双抗），继续在37 ℃5%的二氧化碳培养箱中培养PK-15 猪肾细胞。24 h 后，倒掉培养瓶中液体，分别向对照组和BPA 攻毒组加入2 mL 的细胞分散液，消化约3 min，倒掉分散液。取5 mL（含3%胎牛血清）MEM培养液将细胞吹散开，然后吸取0.5 mL 细胞悬液置于1.5 mL 离心管中，贴好标签，放于4 ℃冰箱中备用。

1.3.1 三明治胶板的制备 第1 层凝胶的制备：取80 μL 保存于56 ℃正常熔点琼脂糖（0.5%）滴在磨砂载玻片的中心处，拿一片盖玻片从左到右缓慢放下，使盖玻片下的胶体内无气泡，4 ℃下凝固10 min；第2 层凝胶的制备：取事先配好的保存于37 ℃的低熔点琼脂糖（0.5%）75 μL 加入10 μL 含有不同浓度梯度的BPA 细胞悬液（105个/mL），用移液枪缓慢吸打混匀，取适量细胞悬液滴在第1 层凝胶上，放置盖玻片，4 ℃下凝固10 min；第3 层凝胶的制备：取85 μL 37 ℃预热的低熔点琼脂糖（0.5%）滴在已经制备好的第2 层凝胶上，盖上盖玻片，避免产生气泡，4 ℃下凝固10 min。

1.3.2 裂解PK-15 猪肾细胞 将完全凝固的载玻片放入4 ℃预冷的细胞裂解液中，在4 ℃下裂解3 h 左右（注意：细胞裂解液临用前再加入1%体积的Triton-X-100 和10%的DMSO）。

1.3.3 碱解旋 3 h 后，取出三明治胶板，PBS 反复冲洗后晾干。把晾干后的三明治胶板水平置于凝胶电泳槽阳极端，向电泳槽中缓慢倒入4 ℃预冷的碱性电泳缓冲液，碱解旋20 min（注意：碱性电泳缓冲液液面要在胶板上方0.25 cm 左右）。

1.3.4 电泳与染色 常温下，胶板在25 V、30 mA下电泳20 min。电泳结束后，将载玻片按照从高到低的BPA 浓度放入托盘中，向托盘中缓慢倒入4 ℃预冷的Tris-HCl 中和液，待液体完全浸没胶板后中和15 min。最后在胶板上悬空滴入适量的30 μg/mL的EB 染色液，暗室染色10 min，并立即在荧光倒置显微镜下观察。

1.4 细胞凋亡评估

为了评估BPA 诱导的细胞凋亡情况，将PK-15猪肾细胞以密度为1×105个/孔接种在96 孔细胞培养板中培养48 h，将细胞暴露于10-3、10-4、10-5、10-6mol/L 的BPA 中24 h。然后，用PBS 清洗并用-20 ℃预冷丙酮固定30 min，再用PBS 清洗。之后，将100 μL Hoechst 33342 染料（2 mg/mL）加入培养基中，37 ℃孵育5 min。在荧光显微镜下，统计3 个不同区域出现高度凝聚（浓缩）或碎裂的PK-15 猪肾细胞核。共检测了200 个PK-15 猪肾细胞并计算各组细胞凋亡百分率。

1.5 数据处理与统计分析

所有数据都以平均值±标准误表示。采用彗星分析软件1.2.2（Comet Assay Software Project，CASP）对每张载玻片25 个随机选择的非重叠细胞进行显微镜下检测和分析。使用GraphPad Prism 5.0 软件对数据进行统计分析。采用单因素方差分析检测处理组之间的差异，之后用Turkey's 多重比较作为事后检验。P＜0.05 被认为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 BPA 对PK-15 猪肾细胞彗星细胞率的影响

每张载玻片随机选25 个细胞，计数彗星（拖尾）细胞数并计算彗星细胞率。试验结果显示，4 个BPA处理组（10-3、10-4、10-5、10-6mol/L）PK-15 猪肾细胞的彗星细胞率分别为93.10%±2.22%、81.05%±4.91%、61.02%±4.01%、38.99%±3.59%，均比对照组的彗星细胞率（20.19%±1.98%）极显著提高（P＜0.01），并且随着BPA 浓度的升高，彗星细胞率显著增加（图1）。

2.2 BPA 对PK-15 猪肾细胞拖尾长度 （尾长）的影响

对PK-15 猪肾细胞在标准条件下进行碱性单细胞凝胶电泳，图2 为BPA 诱导PK-15 猪肾细胞典型的彗星结构图像和DNA 单链断裂情况。彗星细胞的典型图像清楚地显示，随着BPA 剂量的增加，从彗星头部释放出来的DNA 断裂程度增加（图2）；且随着BPA 浓度（10-3、10-4、10-5、10-6mol/L）的减小，PK-15 猪肾彗星细胞尾长缩短，分别为（57.86±2.21）μm、（41.01 ±4.13）μm、（33.02 ±3.79）μm、（23.66±3.94）μm，与对照组相比（尾长为（11.61±3.12）μm）差异显著（P＜0.01）（图3）。

2.3 BPA 对PK-15 猪肾细胞尾部DNA 含量的影响

采用Comet Assay Software Project（CASP）1.2.2和GraphPad Prism 5.0 软件对对照组以及10-3～10-6mol/LBPA 处理的试验组进行了PK-15 猪肾细胞彗星细胞尾部DNA 百分含量分析。由图4 可知，与对照组尾部DNA 百分含量（2.04%±0.62%）相比，不同浓度BPA（10-3、10-4、10-5、10-6mol/L）激发的PK-15 猪肾细胞彗星细胞尾部DNA 百分含量分别为39.59%±2.81%、27.68%±1.92%、16.03%±1.09%、8.41%±0.64%，呈剂量依赖性升高，均极显著高于对照组（P＜0.01）。

2.4 BPA 对PK-15 猪肾细胞尾矩的影响

尾矩是彗星细胞尾长与细胞尾部DNA 百分含量的乘积。在细胞高度损伤剂量下，尾矩与细胞损伤程度呈线性关系。从图5 可以看出，10-3、10-4、10-5、10-6mol/L BPA 处理的PK-15 猪肾细胞尾矩分别为23.11±1.49、11.52±0.78、5.14±1.36、1.96±0.79，与对照组（0.21±0.12）相比差异极显著（P＜0.01），并且随着BPA 浓度的降低，尾矩下降，相应的细胞损伤程度下降。

2.5 BPA 诱导PK-15 猪肾细胞的细胞凋亡

凋亡细胞出现萎缩或凝聚的细胞核。从图6 可以看出，对照组中几乎没有凋亡的PK-15 猪肾细胞。由图7 可知，暴露于不同浓度（10-3、10-4、10-5、10-6mol/L）BPA 的PK-15 猪肾细胞凋亡率随着BPA浓度的升高而升高，BPA 暴露组PK-15 猪肾细胞细胞凋亡呈剂量依赖性增加（P＜0.01）。

3 结论与讨论

BPA 被广泛用于生产环氧树脂和聚碳酸酯塑料。在恶劣的环境下，这些塑料可能会释放可渗入环境的BPA，但是，关于BPA 对动物慢性肾病的有害影响及其作用机制的报道很少。通过研究得知，随着BPA 浓度的升高，PK-15 猪肾细胞细胞核DNA 损伤增强；彗星细胞率、彗星细胞DNA 尾长、细胞尾部DNA 百分含量和尾矩均比对照组显著提高。表明随着BPA 浓度的升高，相应的细胞核DNA损伤程度也在加剧。研究结果也证实了，暴露于BPA的PK-15 猪肾细胞凋亡细胞的数量明显高于对照组，表明BPA 可特异地诱发PK-15 猪肾细胞凋亡，即暴露于BPA 可诱导PK-15 猪肾细胞DNA 损伤和细胞凋亡。

彗星试验是一种检测单细胞中DNA 链断裂的电泳技术。由于其简便、快速、灵敏、无需放射免疫和检测细胞数量少等优点，适用于不同类型的体内外试验和各种类型的细胞DNA 损伤研究。通常，细胞核的DNA 分子量很大，是一种超螺旋结构，并且附着在细胞核的基质中[16，26]。用正常熔点琼脂糖和低熔点琼脂糖凝胶呈三明治夹心法将PK-15 猪肾细胞包埋在磨砂的载玻片上，在碱性裂解液的作用下，细胞膜和核膜被破坏，使PK-15 猪肾细胞内的蛋白质、RNA 以及其他成分进入琼脂糖凝胶，并进一步扩散到碱性裂解液中，只有PK-15 猪肾细胞的细胞核DNA 仍然附着在其核骨架上且留在原位。若PK-15 猪肾细胞未受到BPA 损伤，电泳时细胞核DNA 就会因其分子量较大而留在PK-15 猪肾细胞细胞核基质中，经EB 染色后呈现圆形的橘红色荧光团，无彗星拖尾现象；若PK-15 猪肾细胞受到BPA 损伤，则在碱性的凝胶电泳液中，首先是PK-15 猪肾细胞核DNA 双链解螺旋成为单链，之后单链断裂的碎片因其分子量较小可进入琼脂糖凝胶中，在凝胶电泳时断裂或碎片DNA 离开PK-15 猪肾细胞核DNA 向阳极迁移，并形成拖尾。PK-15 猪肾细胞受到BPA 损伤愈严重，细胞核DNA 损伤也愈严重，产生的DNA 断链愈多，其短片段或断链也就愈小，在凝胶电泳电场作用下迁移的PK-15 猪肾细胞细胞核DNA 的百分含量越高，迁移的距离也越长，表现为PK-15 猪肾细胞核DNA 尾长增加和尾部橘红色荧光强度增强。因此，通过测定PK-15 猪肾细胞核中DNA 的彗星细胞率、尾长、尾部DNA 百分含量和尾矩就可定量测定单个PK-15 猪肾细胞DNA 的损伤程度。

在本研究中，BPA 可引起严重的PK-15 猪肾细胞DNA 片段损伤和明显的拖尾，随着BPA 浓度的升高，可发现DNA 损伤增强，彗星细胞率、尾长、彗星细胞尾部DNA 和尾矩增加，可能的原因是BPA 通过提高氧化应激损伤和抑制DNA 损伤的修复途径影响了PK-15 猪肾细胞核DNA 双链的稳定性。

此外，BPA 可诱导组织细胞内自由基含量增多，造成脂质过氧化程度加剧，抗氧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的产量降低[26]。组织细胞内自由基增多，可促使细胞中的多种物质发生氧化，进一步影响细胞内生物酶的活性，导致细胞凋亡率增加。所以，自由基产生增加与BPA 毒性密切相关，是BPA 损伤组织细胞的中心环节。

在本研究中，随着BPA 浓度的升高，自由基直接作用于核酸，引起核内DNA 双链断裂程度增加，进而引发脂质过氧化作用而造成DNA 链损伤增强，出现明显的拖尾现象，彗星细胞率、尾长、彗星细胞尾部DNA 百分含量、尾矩和细胞凋亡率增加，说明暴露于BPA 细胞的遗传毒性是不容忽视的。

综上所述，本研究选择4 个不同浓度BPA（10-3、10-4、10-5、10-6mol/L）处理PK-15 猪肾细胞，24 h 后进行单细胞凝胶电泳和Hoechst 细胞凋亡检测和分析，发现随着BPA 浓度的升高，猪肾细胞DNA 损伤和细胞凋亡加剧。本研究为BPA 对动物肾脏的毒性作用研究提供了一定的信息，下一步实验室将进行BPA 对小鼠肾脏的影响及分子损伤机制研究。