PAMs 移除猪红细胞表面GFP-Escherichia coli 的体外观察

凌小雅，朱乐乐，孙加乐，王 缘，张睿玉，薛晓姝，尹 伟

（山西农业大学动物医学学院，山西太谷 030801）

1981 年，美国生殖免疫学家SIEGEL 等[1]在总结前人研究的基础上提出了“红细胞免疫系统”的概念，证实了红细胞不仅具有呼吸功能，还具有免疫功能。研究最为广泛也是红细胞最主要的免疫功能是免疫黏附，其最重要的物质基础是红细胞膜上的Ⅰ型补体受体（Complement receptor 1，CR1），在CR1 的介导下，红细胞能够黏附被补体C3b/C4b 致敏的微生物病原体或免疫复合物（Immune complex，IC），将这些物质经血液循环运送至肝脏和脾脏，然后由吞噬细胞清除[2-4]。

兽医学研究表明，猪红细胞同样具有免疫黏附功能，硒中毒[5]、附红细胞体感染[6]等均会导致猪红细胞免疫黏附功能的损伤。李宏全等[7-8]对猪红细胞免疫功能开展了系统的研究，发现猪红细胞能够黏附被补体致敏的大肠杆菌，证实了猪红细胞表面存在类Ⅰ型补体受体（Complement receptor type 1-like，CR1-like），CR1-like 是介导猪红细胞免疫黏附的重要分子基础。为了阐明吞噬细胞与猪红细胞相互作用清除免疫复合物的分子机理，李宏全等[9]围绕猪红细胞转移呈递免疫复合物及机理等科学问题开展了相关研究，结果表明，在体外静态共孵育条件下，猪红细胞与PAMs 相互作用，并可将黏附的致敏抗原转移给PAMs。

本研究改进了原先的静态孵育条件，运用平行板流动小室灌流系统模拟血液在动物体内的生理条件，观察免疫复合物从猪红细胞向猪肺泡巨噬细胞（PAMs）转移的动态过程，为进一步探究猪红细胞通过免疫黏附作用协助清除感染的微生物颗粒的生物学过程及分子机制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物、细胞及菌株 健康的40 日龄长白猪仔猪1 头（20±2 kg），购自太谷县冠农农牧科技有限公司，室温条件下饲养，自由采食饮水；猪肺泡巨噬细胞（PAMs）、表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌（GFP-Escherichia coli），均由山西农业大学临床兽医实验室提供。

1.1.2 主要试剂 Hank's 缓冲液和多聚-L- 赖氨酸购自索莱宝生物科技有限公司；RPMI-1640 培养基购自美国Gibco 公司；猪外周血红细胞分离试剂盒购自天津灏洋生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器 正置荧光显微镜（型号为BX51）和倒置荧光显微镜（型号为IX81）均购自OLYMPUS 公司；低速冷冻离心机（型号为KDC-2046）购自安徽中科中佳科学仪器有限公司；流式细胞仪（型号为C6 plus）购自美国BD 公司；蠕动泵（型号为YZ1515x）购自河北保定领英公司；洁净工作台（型号为SW-CJ-2FD）购自上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；Parallel-Plate Flow ChamberCR@3（型号为31-001）购自美国GlycoTech 公司。

1.2 方法

1.2.1 致敏GFP-Escherichia coli 悬液制备 无菌条件下采集猪前腔静脉血5 mL 于普通采血管中，室温条件下放置30 min，凝血后4 ℃，3 000 r/min 下离心10 min，吸取上层血清，血清在3 000 r/min 下多次离心至无红细胞沉淀，4 ℃保存备用。按照文献报道研究方法制备GFP-Escherichia coli 悬液[10]。向GFP-Escherichia coli 悬液中加入30%的猪血清，37 ℃避光振荡孵育15 min。孵育完毕后，4 000 r/min离心5 min，重复洗涤2 次，重悬，即得致敏GFPEscherichia coli 悬液。

1.2.2 PAMs 的活性检测 复苏PAMs，检测细胞存活率和细胞对致敏GFP-Escherichia coli 的捕获活力。细胞存活率的检测采用台盼蓝染色法。PAMs 对致敏GFP-Escherichia coli 捕获活力的检测步骤如下：首先将PAMs 接种于含0.01%多聚-L- 赖氨酸洗涤液洗涤后的洁净载玻片上，待细胞贴壁后用1 mL 致敏GFP-Escherichia coli 菌悬液孵育1 h，孵育结束后洗涤，显微镜下镜检。最后，采用胰酶消化细胞，用流式细胞仪检测PAMs 捕获致敏GFP-Escherichia coli 的阳性细胞率。

1.2.3 猪红细胞黏附致敏GFP-Escherichia coli 样品制备 无菌采集猪前腔静脉血2 mL 于枸橼酸钠抗凝管中。按照猪红细胞分离液试剂盒说明书分离猪红细胞，调节细胞浓度为1.0×107个/mL，显微镜下观察细胞形态。在37 ℃、避光条件下与致敏GFP-Escherichia coli 共孵育15 min，1 500 r/min 离心洗涤，重悬，显微镜镜检，并用流式细胞仪检测阳性细胞率，确定红细胞成功黏附致敏GFP-Escherichia coli。

1.2.4 PAMs 移除猪红细胞表面GFP-Escherichia coli 的观察 将平行板流动小室盖在复苏的PAMs载玻片上，在倒置荧光显微镜下，连接导管及蠕动泵，流动相瓶内装黏附有致敏GFP-Escherichia coli的猪红细胞悬液，设定蠕动泵转速为4 r/min，启动蠕动泵。选定观察视野，记录视野内PAMs 捕获红细胞表面致敏GFP-Escherichia coli 的过程。

2 结果与分析

2.1 PAMs 的鉴定及活性

将分离所得的PAMs 复苏培养，在倒置显微镜下观察，细胞呈圆形，形态大小均一（图1-A）。加入台盼蓝染色液，镜检计数后计算出PAMs 存活率为98.3%。将PAMs 与致敏GFP-Escherichia coli 置于37 ℃下孵育1 h，显微镜下观察到PAMs 表面及内部结合有GFP-Escherichia coli 绿色荧光菌体（图1-B，白色箭头所示），说明PAMs 具有捕获致敏GFP-Escherichia coli 的活性，用流式细胞仪检测出PAMs 吞噬及黏附活力为92.4%（图2）。

2.2 猪红细胞黏附致敏GFP-Escherichia coli 样品鉴定

致敏GFP-Escherichia coli 与猪红细胞共孵育后，在正置荧光显微镜下观察。猪红细胞形态正常，表面结合有绿色荧光杆状菌体（图3，白色箭头所示），表明猪红细胞成功黏附GFP-Escherichia coli，用流式细胞仪检测出猪红细胞黏附致敏GFP-Escherichia coli 的阳性细胞率为20.6%（图4）。表明猪红细胞免疫黏附致敏GFP-Escherichia coli 的样品制备成功，可用于后续试验。

2.3 猪红细胞向PAMs 转移GFP-Escherichia coli 的观察

连接平行板流动小室、蠕动泵、导管等装置构建体外细胞互作体系。启动蠕动泵，将黏附有GFPEscherichia coli 的猪红细胞注入平行板流动小室与PAMs 相接触，循环流动，在倒置显微镜下选定视野进行观察（图5）。结果显示，在黏附GFP-Escherichia coli 的猪红细胞与PAMs 相接触的短时间内PAMs表面即可出现GFP-Escherichia coli 荧光点，随着时间推移，PAMs 表面的荧光点增多；当观察至2 min 19 s 时，视野中出现黏附有致敏GFP-Escherichia coli 的猪红细胞（白色圆形，图5-a～c），随液流方向行进至10 点钟方向的PAM处（白色箭头），2 min 20 s 时红细胞不再流动，与PAM相接触，绿色荧光点位于红细胞与PAM交界处（图5-d）；1 min 06 s 后（3 min 26 s），红细胞与PAM的连接逐渐断开，只留下PAM 与GFP-Escherichia colii（图5-e～h），随后PAM形态发生变化，细胞粒径增大，该PAM表面目标GFP-Escherichia coli 绿色荧光点减弱，40 min 21 s荧光消失（图5-i）。从以上结果可以看出，猪红细胞免疫黏附致敏GFP-Escherichia coli 后，能够与PAMs 发生相互作用。在此过程中，猪红细胞表面的GFP-Escherichia coli 能够被PAMs 捕获，且红细胞形态未发生明显变化。

3 结论与讨论

研究表明，红细胞具有免疫黏附功能，其表面的CR1 能够粘附补体致敏的病原体并将其运送至吞噬细胞吞噬清除。LI 等[11]证明了CR1 介导的免疫黏附对血液中肺炎链球菌的清除有实际的影响。BREKKE 等[12]研究发现，红细胞能快速与人全血孵育后的野生型脑膜炎奈瑟菌和大肠杆菌结合，诱导白细胞吞噬。SALAM等[13]将人血清、丙型肝炎病毒、红细胞混合后静态孵育，RNA 定量检测发现人红细胞能够与丙型肝炎病毒结合，而CR1 抗体的介入会阻断这种结合。此外，红细胞的免疫黏附还能介导巨噬细胞对内源性免疫复合物的清除。β 淀粉样蛋白（Amyloid β peptide，Aβ）在脑部沉积是阿尔兹海默症诊断指标中最重要的一项[14]，Aβ 蛋白可透过血脑屏障从脑部转移至外周循环，未能从血液中清除的Aβ 蛋白可能持续地在脑部沉积[15]，BRUBAKER等[16]对血液中清除Aβ 蛋白的机制进行了研究，证明人红细胞能够免疫黏附Aβ 蛋白，通过对体内试验中雄性食蟹猕猴肝脏的电子显微镜观察得出，红细胞可将黏附的Aβ 蛋白运送至枯否氏细胞并被清除；Aβ 抗体的存在可显著提高血液循环中红细胞对Aβ 蛋白的清除率[17-18]。然而，此类研究多借助于流式细胞术和ELISA 进行，而红细胞免疫黏附IC并被吞噬细胞清除过程缺乏直接可视化的证据。

HEPBURN 等[19]建立了一种可以研究单个吞噬细胞受体在红细胞向人单核巨噬细胞转移IC 过程中作用的体外模型。在这个模型中，这些单层的细胞暴露在结合有IC 的人红细胞中，通过一种平行板流动系统进行灌流。在此研究基础上，山西农业大学临床兽医实验室改进了原先的静态观察研究方法，成功构建了猪红细胞与PAMs 的细胞动态互作模型[20]。该模型模拟了血液在体内的剪切力参数，让体外观察模型更加贴近体内环境，提高了试验的科学性和准确性。免疫黏附GFP-Escherichia coli 的猪红细胞经血液循环流经PAMs，可在荧光显微镜下实时观察，视野中粘附有GFP-Escherichia coli 的猪红细胞流动至PAMs 处停留，绿色荧光点位于红细胞与PAMs 交接处。随后，猪红细胞脱离连接，GFP-Escherichia coli 完全转移至PAMs 并被PAMs吞噬清除，这是典型的转移过程。除此之外，该视野中还有其他位置能够观察到猪红细胞黏附着GFP-Escherichia coli 与PAMs 接触互作，可见PAMs能够清除黏附在猪红细胞表面的GFP-Escherichia coli。这为猪红细胞免疫粘附介导IC 清除的研究提供了直接可视化证据。

为了深入认识吞噬细胞与红细胞相互作用清除IC的分子机理，学术界开展了大量的研究。EMLEN等[21]用热聚合的人IgG（HAGG）作为IC 模型研究IC 在人红细胞和单核细胞之间的转移反应。通过阻断CR1、FcRⅡ、CR3 等单核细胞受体发现，CR1 在IC 转移过程中起到了主要作用。HEPBURN 等[19]用特异性中和抗体进行的阻断研究表明，IC 转移是补体受体和Fcγ 受体共同作用的结果。有研究表明，PAMs 表面存在与猪红细胞同源的CR1-like 分子，且PAMs 表面CR1-like 相对数量是猪红细胞的4～5 倍，阻断CR1 和FcR 可影响PAMs 对猪红细胞表面IC 的清除[15]。在平行板流动小室细胞动态互作模型中，流动的免疫黏附有IC 的猪红细胞可能通过FcR 介导与PAMs 的结合停留，继而通过FcR和CR1-like 的竞争性结合作用，IC 由红细胞转移至PAMs 并被PAMs 内化清除。

本试验成功拍摄到PAMs 移除猪红细胞表面GFP-Escherichia coli 的过程，为猪红细胞免疫黏附介导IC 清除的研究提供了直接可视化的证据，为进一步探究猪红细胞通过免疫黏附功能协助清除感染的微生物粒子的生物学过程及其分子机制提供了理论依据。