丹参多酚酸盐通过抑制内质网应激减轻小肠缺血再灌注损伤的研究*

李贵宾

（冀中能源峰峰集团有限公司总医院邯郸院区外科，邯郸 056002）

肠缺血再灌注（I/R）损伤是临床上常见的并发症，多见于肠道手术、重度感染、休克、心功能不全等疾病，是导致肠内毒素、细菌进入血液循环，刺激炎症介质、趋化因子等大量释放，进而引发多器官功能障碍综合征[1-2]。病理学研究发现，炎症反应及继发性细胞凋亡是肠I/R损伤发生发展的重要机制[3-4]。

丹参多酚酸（SAL）是中药丹参的主要活性成分，包括丹参酚酸A、丹参酚酸B、丹参素、原儿茶醛等，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多种生物学活性[5-6]，目前临床上主要用于缺血性心血管疾病的治疗。近年来研究发现，丹参酚酸A能够通过抑制细胞凋亡，丹参酚酸B能够通过抑制炎症反应减轻I/R损伤[7-8]。内质网应激是机体调节炎症反应和细胞凋亡的重要通路[9-10]，本研究将复制小肠I/R损伤大鼠模型并于造模前给予SAL进行预处置，研究SAL对小肠I/R后内质网应激的影响，进一步探讨SAL对小肠I/R损伤的保护作用机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级雄性Wistar大鼠144只，7周龄，体质量（220±20）g，购自河北医科大学实验动物中心[SYXK（冀）2018-004]，实验前适应性饲养7 d。光照黑暗 12 h∶12 h 交替、温度（25±1）℃、相对湿度（60±5）%。实验前12 h禁食禁水。

1.2 药物与试剂 注射用丹参多酚酸盐（SAL，规格50mg/瓶）购自上海绿谷制药有限公司（批号190527）；银杏叶提取物注射液（EGB，规格 5 mL∶17.5 mg）购自悦康药业集团有限公司；C反应蛋白（CRP）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒和原位末端转移酶标记（TUNEL）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；糖调节蛋白78（GRP78）、c-Jun 氨基端激酶（p-JNK）、增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）、核因子-κB（NF-κB）、激活型半胱氨酸蛋白酶-3（Cleved Caspase-3）抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）试剂盒、增强化学发光（ELC）试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司。

1.3 动物分组、给药与模型制备 将144只实验用Wistar大鼠进行数字编码，按照随机数字表法分为假手术组（Sham 组），I/R 组，SAL低（10 mg/kg）、中（20 mg/kg）、高（40 mg/kg）剂量组[11]和 EGB 组（阳性对照组，3.15 mg/kg）[12]，每组24只。各组于造模前30 min腹腔注射给药进行预处置，Sham组和I/R组给予生理盐水。除Sham组外，其余各组大鼠均参照武向鹏等[13]报道的方法，通过手术分离并夹闭肠系膜上动脉60 min的方法复制小肠I/R损伤大鼠模型。再灌注120 min后行各指标检测。

1.4 肠组织含水量的测定 各组随机取8只大鼠，麻醉后开腹取回盲部10 cm以上部位的肠管，用生理盐水将肠内容物和血液冲洗干净、滤纸拭干后称质量为湿质量（W1），置95℃烤箱烘烤至恒质量后称质量为干质量（W2），含水量（%）=[（W1-W2）/W1]×100%。

1.5 肠组织病理学检查与细胞凋亡观察 各组随机取8只大鼠，麻醉后开腹取回盲部10 cm以上部位的肠管，用生理盐水将肠内容物和血液冲洗干净后置4%多聚甲醛溶液固定72 h后，液体石蜡浸润包埋、5 μm厚度连续切片，经二甲苯透明和梯度乙醇脱水处理后。1）行常规HE染色，封片后通过光学显微镜肠组织病理学变化；采用Chiu’s氏评分标准进行损伤评分：未见异常计0分，肠黏膜绒毛顶端上皮下间隙增宽计1分，绒毛尖端上皮抬高与固有层剥离计2分，绒毛两侧上皮成块脱落计3分，上皮完全脱落计4分，黏膜固有层崩解并出血计5分。2）遵照TUNEL试剂盒操作说明行染色处理，50%甘油封片后通过光学显微镜观察细胞凋亡状况（细胞核黄褐色为阳性着色）；凋亡指数（AI）的计算：分别计数视野中总细胞数和阳性细胞数，AI（%）=（阳性细胞数/总细胞数）×100%。

1.6 肠组织炎症因子水平检测 取各组剩余的8只大鼠，麻醉后开腹取回盲部10 cm以上部位的肠管，用4℃预冷生理盐水将肠内容物和血液冲洗干净后，剪碎、加入9倍量4℃预冷裂解液、研磨匀浆，3 000 r/min，离心半径 10 cm，离心 10 min，取上清液，然后遵照ELISA试剂盒操作说明处理，通过酶标仪检测肠组织CRP、TNF-α、IL-1β水平。

1.7 肠组织蛋白表达检测 取肠组织匀浆液，4℃、12 000 r/min，离心半径8 cm，离心20 min取上清液，检测总蛋白含量后通过95℃水浴使蛋白变性，30 μg蛋白量上样、SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、丽春红染色、5%脱脂奶粉溶液37℃封闭60 min，磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液）洗膜3次后滴加目标蛋白抗体、β-actin抗体4℃孵育过夜，PBS溶液洗膜后滴加IgG二抗室温孵育1 h，PBS溶液洗膜后滴加ELC发光试剂显色，以β-actin为内参，通过凝胶成像系统半定量目标蛋白表达量。

1.8 统计学方法 运用SPSS 24.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SAL对小肠I/R损伤大鼠肠组织含水量的影响 与Sham组比较，I/R组大鼠肠组织含水量显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与I/R组比较，SAL中、高剂量组和GBE组含水量降低，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；SAL高剂量组含水量与EGB组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 SAL对小肠I/R损伤大鼠肠组织病变及Chiu’s氏评分的影响 Sham组大鼠肠组织未见病理性形态结构改变；I/R组可见肠系膜组织结构紊乱、上皮细胞脱落、固有层分离、大量炎性细胞浸润等病变；与I/R组比较，SAL低、中、高剂量组和EGB组上述病变呈不同程度减轻，其中SAL高剂量组肠系膜结构较完整、炎性细胞明显减少，效果优于其他组。计算Chiu’s氏评分：与Sham组比较，I/R组大鼠Chiu’s氏评分显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与I/R组比较，SAL中、高剂量组和EGB组Chiu’s氏评分显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与EGB组比较，SAL高剂量组Chiu’s氏评分显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1、表1。

图1 SAL对小肠I/R损伤大鼠肠组织病变的影响（HE，×200）Fig.1 The effect of SAL on the pathological changes of intestinal tissue in rats with small intestinal I/R injury(HE，×200)

2.3 SAL对小肠I/R损伤大鼠肠细胞凋亡及AI的影响 Sham组大鼠肠组织可见极少量的凋亡细胞；模型组凋亡细胞数量明显增多，AI较Sham组显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与I/R组比较，SAL中、高剂量组和EGB组凋亡细胞数量明显减少，AI较I/R组显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与EGB组比较，SAL高剂量组AI显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。

表1 SAL对小肠I/R损伤大鼠肠组织含水量、Chiu’s氏评分和 AI的影响（±s）Tab.1 The effect of SAL on intestinal tissue water content，Chiu’s score and AI in rats with small bowel I/R injury（±s）

表1 SAL对小肠I/R损伤大鼠肠组织含水量、Chiu’s氏评分和 AI的影响（±s）Tab.1 The effect of SAL on intestinal tissue water content，Chiu’s score and AI in rats with small bowel I/R injury（±s）

注：与 Sham 组比较，*P<0.01；与 I/R 组比较，#P<0.05，##P<0.01；与 EGB 组比较，△P<0.05，△△P<0.01。

组别S h a m组I/R组S A L低剂量组S A L中剂量组S A L高剂量组E G B组动物数含水量（%） C h i u’s氏评分（分）A I（%）8 8 8 8 8 8 7 3.0 1±3.8 3 0.3 6±0.1 3 3.3 8±0.6 5 8 4.6 7±5.9 4* 3.7 4±0.5 2* 4 3.7 2±6.1 8*8 2.5 0±6.1 1 3.6 0±0.5 7 3 8.1 4±5.9 0 7 7.8 6±4.8 5# 2.8 1±0.4 6## 2 3.5 8±4.0 2##7 4.9 4±4.1 7## 1.6 5±0.2 8##△ 1 4.1 3±2.7 5##△△7 6.2 8±4.5 3## 2.0 3±0.3 5## 1 8.6 4±2.9 9##

2.4 SAL对小肠I/R损伤大鼠肠组织炎症因子水平的影响 与Sham组比较，I/R组大鼠肠组织炎症因子CRP、TNF-α、IL-1β水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与I/R组比较，SAL中、高剂量组和EGB组CRP、TNF-α、IL-1β水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与EGB组比较，SAL高剂量组CRP、TNF-α水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。见表2。

表2 SAL对小肠I/R损伤大鼠肠组织炎症因子水平的影响（±s）Tab.2 The effect of SAL on the levels of inflammatory factors in intestinal tissue of rats with small intestinal I/R injury（±s）

表2 SAL对小肠I/R损伤大鼠肠组织炎症因子水平的影响（±s）Tab.2 The effect of SAL on the levels of inflammatory factors in intestinal tissue of rats with small intestinal I/R injury（±s）

注：与Sham组比较，*P<0.01；与I/R组比较，##P<0.01；与EGB组比较，△P<0.05，△△P<0.01。

组别S h a m组I/R组S A L低剂量组S A L中剂量组S A L高剂量组E G B组动物数8 8 8 8 8 8 C R P（m g/g） T N F-α（n g/g） I L-1 β（n g/g）4 1.6 4±5.0 8 1 1.3 7±1.6 5 4 3.6 7±5.2 9 1 8 5.6 3±3 1.4 9* 4 3.0 5±7.2 8* 9 2.1 4±1 5.6 2*1 6 2.4 7±2 8.3 6 3 7.1 8±7.0 3 8 5.0 6±1 4.3 4 1 3 5.8 1±2 2.4 5## 2 8.4 4±5.1 9## 6 9.2 8±1 1.5 0##9 3.6 8±1 6.7 5##△△ 1 9.6 4±3.2 6##△ 5 7.4 1±8.3 7##1 2 4.7 3±2 0.8 6## 2 4.8 6±3.9 4## 6 3.5 9±9.4 2##

2.5 SAL对小肠I/R损伤大鼠肠组织GRP78、p-JNK、CHOP蛋白表达的影响 与Sham组比较，I/R组大鼠肠组织GRP78、p-JNK、CHOP表达显著上调，差异有统计学意义（P<0.01）；与I/R组比较，SAL低、中、高剂量组和 EGB 组 GRP78、p-JNK、CHOP表达显著下调，差异有统计学意义（P<0.01）；与EGB组比较，SAL高剂量组GRP78、CHOP表达显著下调，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。见图2、表3。

表3 SAL对小肠I/R损伤大鼠肠组织GRP78、p-JNK、CHOP 蛋白表达的影响（±s）Tab.3 The effect of SAL on the expression of GRP78，p-JNK，CHOP protein in intestinal tissue of rats with small intestinal I/R injury（±s）

表3 SAL对小肠I/R损伤大鼠肠组织GRP78、p-JNK、CHOP 蛋白表达的影响（±s）Tab.3 The effect of SAL on the expression of GRP78，p-JNK，CHOP protein in intestinal tissue of rats with small intestinal I/R injury（±s）

注：与Sham组比较，*P<0.01；与I/R组比较，#P<0.01；与EGB组比较，△P<0.05，△△P<0.01。

组别S h a m组I/R组S A L低剂量组S A L中剂量组S A L高剂量组E G B组动物数8 8 8 8 8 8 G R P 7 8/β-a c t i n p-J N K/β-a c t i n C H O P/β-a c t i n 0.1 9±0.0 6 0.1 3±0.0 4 0.2 1±0.0 6 0.9 4±0.1 5* 1.0 5±0.1 9* 1.0 1±0.1 6*0.5 3±0.1 7# 0.9 7±0.1 6 0.7 6±0.1 3#0.4 4±0.1 3# 0.4 8±0.0 9# 0.5 8±0.1 0#0.3 1±0.1 1#△ 0.1 5±0.0 5# 0.4 3±0.0 8#△△0.4 9±0.1 5# 0.1 9±0.0 6# 0.6 1±0.1 2#

图2 SAL对小肠I/R损伤大鼠肠组织GRP78、p-JNK、CHOP蛋白表达的影响Fig.2 The effect of SAL on the expression of GRP78，p-JNK，CHOP protein in intestinal tissue of rats with small intestinal I/R injury

2.6 SAL对小肠 I/R损伤大鼠肠组织 NF-κB、Cleved Caspase-3蛋白表达的影响 与Sham组比较，I/R 组大鼠肠组织 NF-κB、Cleved Caspase-3表达显著上调，差异有统计学意义（P<0.01）；与I/R组比较，SAL中、高剂量组和EGB组NF-κB、Cleved Caspase-3表达显著下调，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；与EGB组比较，SAL高剂量组NF-κB、Cleved Caspase-3表达显著下调，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 3、表 4。

表4 SAL对小肠I/R损伤大鼠肠组织NF-κB、Cleved Caspase-3 蛋白表达的影响（±s）Tab.4 The effect of SAL on the expression of NF-κB，Cleved Caspase-3 protein in intestinal tissue of rats with small intestinal I/R injury（±s）

表4 SAL对小肠I/R损伤大鼠肠组织NF-κB、Cleved Caspase-3 蛋白表达的影响（±s）Tab.4 The effect of SAL on the expression of NF-κB，Cleved Caspase-3 protein in intestinal tissue of rats with small intestinal I/R injury（±s）

注：与 Sham 组比较，*P<0.01；与 I/R 组比较，#P<0.05，##P<0.01；与 I/R 组比较，△P<0.05。

组别 动物数S h a m组 8 I/R组 8 S A L低剂量组 8 S A L中剂量组 8 S A L高剂量组 8 E G B组 8 N F-κ B/β-a c t i n C l e v e d C a s p a s e-3/β-a c t i n 0.2 7±0.0 4 0.0 7±0.0 4 0.4 7±0.0 8* 1.2 5±0.1 6*0.4 2±0.0 9 0.8 7±0.1 4##0.3 7±0.0 6# 0.7 9±0.1 2##0.3 2±0.0 5##△ 0.2 8±0.0 6##△0.3 8±0.0 6# 0.3 6±0.0 8##

图3 SAL对小肠I/R损伤大鼠肠组织NF-κB、Cleved Caspase-3蛋白表达的影响Fig.3 The effect of SAL on the expression of NF-κB，Cleved Caspase-3 protein in intestinal tissue of rats with small intestinal I/R injury

3 讨论

小肠对缺氧缺血非常敏感，小肠I/R损伤在重度感染、创伤、休克、心功能不全等危重疾病病理过程中发挥着重要作用。小肠I/R损伤将导致肠黏膜屏障受损，使肠道毒素和细菌进入血液循环而引发系统性炎症反应综合症，是导致患者死亡的重要因素。因此，防治小肠I/R损伤对改善危重病患者预后至关重要。

丹参以唇形科植物丹参的干燥根和根茎入药，味苦、性微寒，具有活血祛瘀、通经止痛、凉血消痈之功效。SAL为中药丹参的水溶提取物，具有良好的抗炎、抗凋亡等生物活性。本实验采用夹闭肠系膜上动脉的方法复制小肠I/R大鼠模型，该方法制备的动物模型与临床小肠I/R损伤患者病变特征接近，是目前比较公认的造模方法。本研究发现，小肠I/R损伤模型大鼠肠组织呈现水肿，肠系膜组织结构紊乱、上皮细胞脱落、固有层分离、大量炎性细胞浸润等病变，与孙孟彪等[14]研究结果一致。进一步研究发现，经SAL干预能够显著降低小肠I/R损伤大鼠肠组织含水量，改善肠组织病变、降低Chiu’s氏评分，改善细胞凋亡状况、降低AI，并且SAL高剂量组对肠组织Chiu’s氏评分、AI的影响优于EGB组，提示SAL对大鼠小肠I/R损伤具有保护作用。

肠I/R损伤将病理性刺激CRP、TNF-α、IL-1β等炎症因子大量释放，其中TNF-α、IL-1β作为炎性趋化因子能够刺激粒细胞进一步合成与释放炎症因子，从而引发炎症级联反应，导致肠组织烧伤逐渐加重[15]。本研究发现，经SAL干预能够显著降低小肠I/R损伤大鼠肠组织CRP、TNF-α、IL-1β水平，并且SAL高剂量组对CRP、TNF-α的影响优于EGB组，提示SAL对大鼠小肠I/R损伤后炎症反应具有抑制作用。

内质网存在于真核细胞中一种膜性细胞器，具有调节钙稳态、脂质合成等多种生理作用。但缺血性损伤等将病理性刺激内质网功能紊乱，庞志路等[16]研究发现，内质网应激介导细胞凋亡在小肠I/R损伤的重要病理通路。GRP78是存在于内质网的钙离子伴侣蛋白，对维持内质网稳态至关重要，GRP78和p-JNK升高可作为内质网应激标志检测物质[17-18]；内质网应激将诱导促凋亡蛋白CHOP上调表达并激活Caspase-3，进而诱导细胞凋亡[19]。内质网应激能够诱导 NF-κB 表达[20]，NF-κB 则能够刺激 CRP、TNF-α、IL-1β等炎症因子大量释放，既往研究发现通过药物抑制NF-κB表达能够显著降低缺血再灌注损伤大鼠炎症反应[21]。王伟[22]研究发现SAL能够通过抑制内质网应激介导的细胞凋亡减轻大鼠脑缺血再灌注损伤，陈裕琳等[23]研究发现丹参能够通过抑制内质网应激介导的炎症反应减轻大鼠脑缺血再灌注损伤。本研究发现，经SAL干预能够显著下调小肠 I/R损伤大鼠肠组织GRP78、p-JNK、CHOP、NF-κB、Cleved Caspase-3 蛋白表达，并且SAL 高 剂 量 组 对 GRP78、CHOP、NF-κB、Cleved Caspase-3表达的影响优于EGB组，提示SAL抑制小肠I/R损伤大鼠炎症反应和细胞凋亡的作用可能与抑制内质网应激有关。

综上所述，SAL对大鼠小肠I/R损伤具有保护作用，其机制可能与SAL抑制内质网应激通路，进而抑制炎症反应和细胞凋亡有关。