半夏-陈皮“异病同治”咳嗽和冠心病的网络药理学作用机制研究*

万阳 杨奕 刘慧莹 蔡恒斌 李金根 毛祥坤#

（1江西中医药大学 南昌330004；2江中药业股份有限公司 江西南昌330077；3江西省南昌市强制隔离戒毒所 南昌330029）

咳嗽是一种呼吸道常见疾病，占呼吸科门诊的30%左右，病因复杂，部分患者经抗感染治疗后仍无法缓解，长此以往，若得不到有效治疗，将对呼吸系统造成损伤[1]。冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病，是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而致，临床常见冠心病患者易患咳嗽，西医认为与患者心肺功能不全有关[2]。从中医角度而言，咳嗽病位在肺，因肺失宣肃、肺气上逆、冲击气道而致，临床可表现为咳嗽、咳痰，分外感与内伤两种，其中外感咳嗽若不能及时使邪外出，易演变为内伤咳嗽，内伤咳嗽其病理因素多与“痰”相关。冠心病属中医的“胸痹、胸痛”等范畴，病位在心，病理因素与“痰、瘀血”相关。“心为君主之官、肺为相傅之官”，肺能协助“君主之官”调节气血，两者发病亦与“痰”相关，故咳嗽、冠心病在病因病机上常互为关联。半夏、陈皮为临床常用祛痰药，两者常相须为用，作为治疗呼吸、心血管疾病的中药复方核心药在临床上应用广泛[3]。中医治病的法则，不着眼于疾病的异同，关键在于其病机的异同，“异病同治”则是该法则的主要体现。在不同疾病的发生发展过程中，只要出现相同的病机，就可以采用同一方法治疗该病。咳嗽、冠心病在发病过程中，常出现“痰浊阻滞”，用半夏-陈皮药对治疗符合“异病同治”之说。网络药理学是很多学者近年提出的一种采用系统生物学方法来进行药理学研究的新型技术方法，是基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用的网络，能系统综合地观察药物对疾病网络的干预与影响，这与中药的多成分、多途径、多靶点协同作用的原理相似[4]。基于此，本研究运用网络药理学方法，从中医“异病同治”的角度，探究半夏-陈皮治疗咳嗽、冠心病的具体分子机制。现报道如下：

1 研究方法

1.1 药物成分及靶点的查询及筛选 在TCMSP数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）以口服生物利用度（Oral Bioavailability,OB）≥30%或类药性指数（Drug Like Index,DL）≥0.18为标准对中药药对半夏-陈皮的化合物进行筛选[5]。将符合条件的化合物输入Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查找其国际化学标识符（International Chemical Identifier,InChI）及CID，并将其输入BATMAN-TCM数 据 库（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）中，以得分（Score）≥20与调整P值（Adjusted P-value）＜0.05为临界值进行药物靶标的筛选[6]。

1.2 疾病基因的检索 分别在基因疾病关联数据库DisGeNET（http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu）、人类孟德尔遗传综合数据库OMIM（https://www.omim.org/）、药物靶标数据库Drug Bank（https://www.drugbank.ca/）以咳嗽（Cough）、冠心病（Coronary Heart Disease）为词条进行相关疾病基因检索。将所得的咳嗽、冠心病疾病基因进行整合，并应用Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）对基因进行标准化。

1.3 构建半夏-陈皮治疗咳嗽、冠心病交集靶标数据库PPI网络图 将半夏和陈皮中筛选所得的药物靶标分别与咳嗽、冠心病的疾病基因进行映射，分别得出该药对治疗咳嗽、冠心病的靶标。将两个数据集进行整合得到该药对治疗咳嗽和冠心病的共同作用靶基因，合并抽取交集靶基因，得出该药对疾病共同作用的靶标蛋白数据库。将靶标蛋白输入STRING数据库（https://string-db.org），构建PPI网络，用Cytoscape软件（3.8.2）进行可视化分析。根据Cytoscape软件中的Network Analysis plugin插件对图中节点自由度（Degree）进行分析。自由度越大，该节点在网络中的生物功能则越多。根据节点自由度大小进行颜色渲染，颜色由黄色渐变成红色。其中黄色节点表明其Degree较小（生物功能较少），红色节点代表其自由度较大（生物功能较多）。

1.4 基 因 本 体（Gene Ontology,GO）、KEGG PATHWAY通路富集 分别将半夏-陈皮治疗咳嗽、冠心病及其交集靶基因输入DAVID数据库分别进行GO、KEGG分析，以P值＜0.05为标准进行筛选。

1.5 半夏-陈皮治疗咳嗽、冠心病“活性成分-靶标”网络可视化构建 分别将半夏-陈皮作用咳嗽、冠心病的有效作用成分、潜在靶标输入Cytoscape3.8.2 软件，构建“活性成分-靶标”网络图。

2 结果

2.1 半夏-陈皮治疗咳嗽、冠心病靶标 基于DisGeNET、OMIM及Drug Bank数据库查询所得，有230个基因与咳嗽相关，1 658个基因与冠心病相关。经过分析后发现药对半夏-陈皮治疗咳嗽的基因有49个、有效成分69个，治疗冠心病的基因有342个，有效成分87个。

2.2 半夏-陈皮治疗咳嗽、冠心病交集靶标数据库PPI网络图 半夏-陈皮治疗咳嗽、冠心病交集靶标共有24个，将其输入STRING数据库构建PPI网络图，发现除TBPL1之外，其余23个靶标蛋白之间均可相互作用。将23个靶蛋白输入Cytoscape软件进行可视化，PPI网络图显示共有23个节点，聚类系数为0.597，网络密度为0.372，其中生物功能最多的前3个靶标蛋白人白介素1B（IL1B）、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素8（CXCL8）。见图1、图2。

图1 半夏-陈皮治疗咳嗽、冠心病交集靶基因韦恩图

图2 半夏-陈皮治疗咳嗽、冠心病交集靶基因PPI网络图

2.3 半夏-陈皮治疗咳嗽、冠心病交集靶基因GO分析 用DAVID 6.8数据库分别对半夏-陈皮治疗咳嗽、冠心病及其交集靶标进行GO在线富集，经过筛选后发现：药对治疗咳嗽的生物过程（Biological Process,BP）主要集中在炎症反应、对基因表达的正向调控、蛋白质四聚体等方面，细胞组成（Cellular Component,CC）主要集中在胞外部分、细胞表面、细胞质膜的整体组成等，分子功能（Molecular Function,MF）主要表现细胞因子活性、离子通道的活性、钙离子通道活性等方面。中药药对治疗冠心病BP主要集中在对药物反应、炎症反应、对脂多糖的反应等部分，CC主要集中在细胞外部分、细胞质及细胞表面等，MF主要集中在酶结合、细胞因子活性、受体结合等方面。半夏-陈皮治疗咳嗽、冠心病交集靶标BP主要集中在炎症反应、对基因表达的调控、对钙二醇1-单加氧酶活性的正向调控等方面，CC主要集中在细胞外部分、细胞表面、细胞膜等，MF主要表现在细胞因子活性、蛋白质同源二聚体活性、酶结合等方面。见表1~3。

表1 半夏-陈皮治疗咳嗽靶基因GO分析

表2 半夏-陈皮治疗冠心病靶基因GO分析

表3 半夏-陈皮治疗咳嗽、冠心病交集靶基因GO分析

续表

2.4 半夏-陈皮治疗咳嗽、冠心病交集靶基因KEGG分析KEGG PATHWAY通路富集分析发现，中药对治疗咳嗽的主要通路涉及TNF通路、T细胞受体信号通路、Toll样受体通路等25个通路。药对治疗冠心病的主要通路涉及HIF-1通路、TNF通路、AMPK通路等127个通路。半夏-陈皮“异病同治”的主要信号通路涉及NOD样受体信号通路、TNF通路、NF-κB通路、TGF-β通路等炎症相关信号通路。见图3、图4、图5。

图3 半夏-陈皮治疗咳嗽靶基因KEGG PATHWAY富集图

图4 半夏-陈皮治疗冠心病靶基因KEGG PATHWAY富集图

图5 半夏-陈皮治疗咳嗽、冠心病交集靶基因KEGG PATHWAY富集图

2.5 半夏-陈皮治疗咳嗽、冠心病“活性成分-靶标”图 分别将半夏-陈皮药对治疗咳嗽、冠心病的有效活性成分、潜在作用靶标及其通路输入Cytoscape 3.8.2软件，设置节点Degree≥10为标准进行筛选，构建“重要活性成分-靶标”网络图，图中棱形节点代表小分子化合物，圆形节点代表潜在靶点。见图6、图7。

图6 半夏-陈皮治疗咳嗽“重要活性成分-靶标”图

图7 半夏-陈皮治疗冠心病“重要活性成分-靶标”图

3 讨论

半夏为天南星科植物半夏的干燥块茎，味辛、性温，归脾、胃、肺经，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效，现代药理学研究发现其具有止咳平喘、抗消化性溃疡、降压、抗动脉粥样硬化等功效，临床常用于治疗呼吸系统、心血管系统、消化系统、肿瘤等疾病[7]。陈皮为芸香科植物橘及其栽培变种的干燥成熟果皮，味苦、辛，性温，归肺、脾经，具有燥湿化痰、理气健脾之功效，现代药理学研究发现其主要有效成分为黄酮类化合物，具有抗炎、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗过敏等作用，广泛运用于呼吸、心血管、消化等系统疾病[8]。咳嗽为呼吸系统常见疾病，冠心病为心血管常见疾病，中医理论认为两者发病均与“痰”相关，半夏、陈皮两味中药均为燥湿化痰常用药，均归属于脾、肺两经，“脾为生痰之源、肺为储痰之器”，两者常相须为用，是中医临床燥湿化痰之经典药对，其中化痰名方“二陈汤”是其充分体现，临床运用该药对治疗两种疾病均取得较好疗效，亦是“异病同治”之法的体现。

本研究通过网络药理学这种新型的技术手段，对半夏-陈皮治疗咳嗽、冠心病交集靶基因进行GO分析发现，其BP主要集中在炎症反应、对基因表达的调控、对钙二醇1-单加氧酶活性的正向调控等方面，CC主要集中在细胞外部分、细胞表面、细胞膜等，MF主要表现在细胞因子活性、蛋白质同源二聚体活性、酶结合等方面。KEGG PATHWAY通路富集分析发现，半夏-陈皮药对治疗冠心病的分子机制主要涉及HIF-1、TNF、AMPK通路等127个通路，治疗咳嗽的分子机制则主要涉及NOD样受体、T细胞受体、Toll样受体通路等25个通路。药对“异病同治”的主要信号通路涉及NF-κB通路、NOD样受体信号通路、TNF通路、TGF-β等30个信号通路。核 转 录 因 子-κB（Nuclear Factor-kappa B,NF-κB）通路是参与炎症反应的“明星通路”，其存在于多种组织中，具有广泛的生物活性。一般情况下，其以同源或异源二聚体的形式存在于细胞质中，此时其表现为无活性，当其受到一些炎症介质、病毒、自由基等因素刺激时，无活性的NF-κB进入细胞核中并与其相关的靶基因结合，诱导一些炎症介质的表达以发挥其生物学效应，研究发现其与动脉粥样硬化、冠心病、慢性阻塞性肺疾病、哮喘等呼吸、心血管系统疾病相关[9~10]。NOD样受体（NOD-like Receptors,NLRs）属天然免疫系统，是哺乳动物先天免疫系统的重要组成部分，其参与细胞内细菌病原体相关分子模式的识别并可引起下游NF-κB信号通路的激活，从而诱发炎症反应，研究发现其与机体内炎症反应及代谢障碍相关[11]。肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）是一种涉及系统性炎症的细胞因子，可诱导多种炎症介质的释放，是气道炎症的重要介质，其常在咳嗽患者体内表达升高[12]。此外，研究发现冠心病患者体内TNF-α亦过度表达，其作用于冠心病的机制与其促使血管内皮增厚、增加血管内皮平滑肌细胞数量、促使动脉粥样硬化相关[13]。转化生长因子-β（Transforming Growth Factor-β,TGF-β）广泛存在于人体各系统中，TGF-β通路参与细胞生长、分化、凋亡、动态平衡等多种细胞生命活动[14]。其通过促进胶原纤维分泌及沉积、抑制炎症反应、双向调节血管平滑肌等多途径参与冠心病的发生发展，是冠心病发生发展的关键信号通路之一[15]。以上这些信号通路均与炎症反应关系密切，符合半夏-陈皮的药理学，亦与目前咳嗽、冠心病的机制相符。同时，进一步表明半夏-陈皮“异病同治”咳嗽、冠心病是通过多途径、多靶点进行治疗。